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定点饱和突变提高赭曲霉11α羟化酶的催化性能
编辑人员丨2024/3/16
[目的]11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大.赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473 的 11α羟化酶CYP68J5 是转化 17α-羟基黄体酮生成 11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升.[方法]在课题组前期确定的关键氨基酸位点D118、F216 和M488 基础上,通过定点饱和突变和底物转化实验进行优良突变体的筛选;使用AutoDock进行酶与底物的分子对接,并通过Discovery Studio和Gromacs分别研究分子间相互作用力和分子动力学模拟.[结果]突变体D118V、F216W、M488L和M488W具有催化性能,其中,优良突变体D118V的活性最高,其在底物浓度 0.5 g/L时,生产强度为 431.66 mg/(L·d),较野生型提高了 2.12 倍,这可能是因为当 118 位的天冬氨酸突变为缬氨酸后,该位点与底物之间产生了新的疏水相互作用,增强了酶的底物结合口袋的疏水性.分子动力学模拟结果表明酶的整体构象更稳定,酶与底物的结合更紧密.[结论]通过定点饱和突变获得了催化性能显著提升的优良突变体D118V,研究结果为甾体 11α羟化酶的改造提供了应用案例和理论指导.
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编辑人员丨2024/3/16
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17α-羟基黄体酮C11α-羟化菌株的筛选及工艺优化
编辑人员丨2023/11/18
11α,17α-二羟基黄体酮(11α,17α-dihydroxy progesterone)作为甾体激素类药物的重要中间体,其生物合成主要以17α-羟基黄体酮作为底物转化生成.为探究不同微生物对17α-羟基黄体酮的转化能力,以11株具有甾体羟化能力的菌株为研究对象,通过全细胞生物转化实验,筛选得到了 一株转化能力最强的菌株亚麻刺盘孢SF-307.通过单因素实验和正交设计进行菌株发酵培养基组分优化,确定了最适发酵培养基:15 g/L可溶性淀粉、1.8 g/L氯化铵、0.6 g/L氯化镁、3 g/L玉米浆.优化培养基后的亚麻刺盘孢SF-307转化产物唯一,当底物投料量为0.5 g/L,添加1%(V/V)乙醇进行助溶,转化56 h时,底物转化率为93.2%,11 α,17α-二羟基黄体酮的最高浓度为224.1 mg/L,较优化前提高61.1%.上述结果表明:亚麻刺盘孢SF-307作为一株全新的17α-羟基黄体酮羟化菌株,发酵优化可显著增强17α-羟基黄体酮转化产物的选择性,缩短转化周期,对11α,17α-二羟基黄体酮的工业生产意义重大.
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编辑人员丨2023/11/18
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黄体酮对成年斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴相关基因转录表达的干扰效应
编辑人员丨2023/8/6
黄体酮(P4)是一种类固醇激素.为了探究P4的内分泌干扰效应,选择成年斑马鱼(Danio rerio)作为受试生物,研究了P4对斑马鱼下丘脑-垂体-性腺轴(HPG轴)相关基因转录表达影响.成年斑马鱼在不同浓度P4(2、11和16 ng·L–1)下处理21 d.结果显示:暴露于高浓度组的P4能够抑制雌鱼大脑中促性腺激素释放激素2(gnrh2)、促性腺激素释放激素3(gnrh3),卵泡刺激素(fshb)、雌激素受体1(esr1)基因的转录表达;然而诱导了雄鱼大脑中fshb、黄体生成素(lhb)、雄激素受体(ar)基因的转录表达,这些转录变化暗示了P4对成年斑马鱼有潜在的弱雄激素效应.此外,P4暴露对雌鱼卵巢和雄鱼精巢类固醇合成途径中固醇激素合成急性调节蛋白(star)、细胞色素p450介导侧链裂解酶(cyp11a1)、17α羟化酶(cyp17)、卵巢细胞色素P450芳香化酶(cyp19a1a)、11β 羟化酶(cyp11b)、羟基类固醇3β 脱氢酶(hsd3b)、羟基类固醇20β 脱氢酶(hsd20b)、羟基类固醇17β 脱氢酶3(hsd17b3)、羟基类固醇11β 脱氢酶2(hsd11b2)以及受体信号途径中孕激素受体(pgr)、esr1、ar基因的转录表达没有显著影响.可见,在P4暴露下,斑马鱼大脑比性腺更加敏感.总而言之,P4能够改变斑马鱼大脑中HPG轴相关基因的转录表达水平,进而对斑马鱼的内分泌系统具有潜在的危险.
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编辑人员丨2023/8/6
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细胞色素P450还原酶与CYP17的共表达及其功能分析
编辑人员丨2023/8/5
17α-羟基黄体酮(17α-OH-PROG)是甾体激素类药物的关键中间体,其生物合成主要由细胞色素单加氧酶(CYP17)催化生成.在此过程中,细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase,CPR)作为细胞色素P450酶电子传递链的重要组成部分,直接影响CYP17的催化效率.为研究不同来源CPR与17α-羟化酶的适配性,首先以人源17α-羟化酶作为研究对象,构建了表达质粒pPIC3.5k-hCYP17,获得了重组毕赤酵母菌株.其次筛选获得3种不同来源CPR,构建了表达质粒pPICZX-CPR,获得17α-羟化酶与CPR共表达菌株,并在毕赤酵母中进行转化实验,对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析.结果显示,重组菌株具有17α-羟化酶活性,能够催化黄体酮生成目标产物17α-OH-PROG以及副产物16α-羟基黄体酮(16α-OH-PROG).不同来源的CPR与17α-羟化酶共表达与仅表达17α-羟化酶的产率相比均有所提高,其中hCPR-CYP17共表达菌株表现出最高的转化水平,17α-OH-PROG产率提高42%.上述结果表明:17α-羟化酶基因与CPR共表达能够提高其黄体酮17α-羟基化水平.为甾体黄体酮17α-羟基化的生物催化研究提供思路,对甾体药物的工业生产具有重要意义.
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编辑人员丨2023/8/5
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赭曲霉11α羟化酶的克隆表达及关键氨基酸位点分析
编辑人员丨2023/8/5
11α,17α-双羟基黄体酮是甾体激素类药物的重要中间体,工业上主要利用霉菌对17α-羟基黄体酮的11α羟化反应制备.对赭曲霉的11α羟化酶及其关键氨基酸位点展开研究,为深入解析酶的催化机理提供基础数据.利用底物转化实验探究了 10个羟化反应常用霉菌对17α-羟基黄体酮的转化能力,考察了赭曲霉来源的11α羟化酶CYP68J5在不同表达系统中的活性,借助结构预测、分子对接和定点突变等手段对CYP68J5的关键氨基酸位点进行解析.结果表明,赭曲霉的转化能力最强,转化时间60 h的摩尔产率达到最大值,为78.55%;其羟化酶CYP68J5在酿酒酵母中的表达活性最高;位于底物结合口袋附近的D118、F216、M488是CYP68J5的关键氨基酸位点,这些位点在维持酶的结构稳定性上发挥重要作用,是后续分子改造的潜在重要靶点.
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编辑人员丨2023/8/5
