甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是油脂代谢的中间产物,在人体中具有重要的生理功能,主要通过脂肪酶水解油脂制备.但对 1,2-甘油二酯(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)的检测分离方法及脂肪酶的催化特异性的研究较少,限制了其广泛应用.基于以上问题,本研究首先通过超临界流体色谱与蒸发光散射检测器联用,优化检测分析参数,建立了 1,2-DAG(0.025?0.200 g/L)和 1,3-DAG(0.025?0.150 g/L)的高效定量检测方法.进一步基于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)与三油酸甘油酯的分子对接,挑选了 5 个潜在底物结合位点并通过定点饱和突变构建了突变体库,利用超临界流体色谱方法对突变体催化特异性进行筛选.突变文库中I202V表现出最高的 1,3-位置选择特异性,较野生型TLL提高了 11.7%.本文基于半理性设计方法实现了对TLL位置催化特异性的改造,并建立了一种能够高效分离检测DAG位置异构体的方法,为脂肪酶催化特异性研究提供了参考.

[目的]11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大.赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473 的 11α羟化酶CYP68J5 是转化 17α-羟基黄体酮生成 11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升.[方法]在课题组前期确定的关键氨基酸位点D118、F216 和M488 基础上,通过定点饱和突变和底物转化实验进行优良突变体的筛选;使用AutoDock进行酶与底物的分子对接,并通过Discovery Studio和Gromacs分别研究分子间相互作用力和分子动力学模拟.[结果]突变体D118V、F216W、M488L和M488W具有催化性能,其中,优良突变体D118V的活性最高,其在底物浓度 0.5 g/L时,生产强度为 431.66 mg/(L·d),较野生型提高了 2.12 倍,这可能是因为当 118 位的天冬氨酸突变为缬氨酸后,该位点与底物之间产生了新的疏水相互作用,增强了酶的底物结合口袋的疏水性.分子动力学模拟结果表明酶的整体构象更稳定,酶与底物的结合更紧密.[结论]通过定点饱和突变获得了催化性能显著提升的优良突变体D118V,研究结果为甾体 11α羟化酶的改造提供了应用案例和理论指导.

目的:通过定点突变初步表征绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas Aeruginosa arylsulfatase,PAAS)序列-活性关系,识别通过迭代饱和突变提高突变体比活性的合适位点.方法:分析PAAS活性中心三维构象初步识别催化相关位点;定点突变获得突变体,重组表达后Ni2+-NTA亲和纯化,表征其酶学性质.结果:与野生型相比,R55、M72、G138、D317、K375等位点用常见氨基酸替换/突变都显著降低其催化活性;R55、D317和K375等突变显著降低底物选择性和/或热稳定性,而M72和G138突变主要改变其催化活性.结论:M72和G138适合作为通过迭代饱和突变实施定向进化的候选位点.

萜类化合物是自然界中普遍存在的一大类天然产物,其结构多样.倍半萜化合物是萜类化合物的重要组成部分.倍半萜合酶是倍半萜化合物合成过程中的关键酶.本文综述了近年来多种倍半萜合酶的突变研究,阐明了倍半萜合酶的催化机理.

[背景]光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景.本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低.为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDHQ88R,其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍.[目的]为进一步提高L-LcLDHQ88R催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDHQ88R底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile229随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体.[方法]以重组表达质粒pET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDHQ88R基因(LcldhQ88R)中编码Ile229的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库.以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子.[结果]突变转化子(Escherichia coli/LcldhQ88R/I229Q)表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile229的双突变体L-LcLDHQ88R/I229Q.重组表达产物L-LcLDHQ88R/I229Q的酶学性质分析表明:L-LcLDHQ88R/1229Q的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDHQ88R的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍.L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大.根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用.[结论]双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDHQ88R/1229Q在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶.

(S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯[(S)-CHOH]是他汀类药物合成的关键手性中间体.利用醇脱氢酶催化6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯不对称合成(S)-CHOH是很有潜力的制备路线,目前存在的主要问题是醇脱氢酶催化活性较低.首先对来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH(A94T/F147 L/A202L/L199 H)进行回复突变,确定了关键位点147和202,并获得比酶活提高1倍的突变体M F147L-A202L.对这两个位点进行饱和突变,获得比酶活比LkTADH提高1.47倍的突变体MF147I-A202L.其比酶活为10.17U/mg,为目前文献报道最高水平.通过动力学分析和分子对接,分析了突变位点对酶活影响的机制,为后续研究奠定了良好的基础.

[目的]从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性.[方法]根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造.[结果]从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达.酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40℃,最适pH为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741) μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307) mmol/L.该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷.还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究.其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍.[结论]本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值.

目的 构建人工突变的噬菌体展示文库并与天然噬菌体展示文库序列对比,进而对人工突变的噬菌体展示文库的质量进行科学评价,为纳米抗体的进一步改造提供鉴.方法 对结合人卵泡刺激素受体(FSHR)的纳米抗体的抗原互补决定区3(CDR3)进行NNY定点饱和突变,合成VHH06-ΔCDR3随机突变DNA.将突变DNA序列连接到载体pMECS上,构建VHH06-ΔCDR3突变噬菌体展示文库.通过DNA测序和分析,比较该文库与FSHR免疫的VHH噬菌体展示文库的多样性和CDR3区的氨基酸分布.采用FSHR对文库进行6轮亲和筛选,测定筛选后克隆的富集程度.结果 按照NNY突变原则,合成了长度为16个氨基酸的CDR3随机突变基因库.成功构建了库容量为7.36×108 cfu/ml的VHH06-CDR3随机突变噬菌体展示文库.多克隆与单克隆phage酶联免疫吸附实验结果显示,经过6轮筛选,输出噬菌体与FSHR的结合明显得到富集,但获得的克隆与FSHR没有明显结合.结论 VHH06-ΔCDR3随机突变噬菌体展示文库尽管具有序列多样性,但由于CDR3缺乏功能多样性,导致其在亲和筛选中不利于获得目标抗体.

α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid,α-KG)是谷氨酸脱氨基的酮酸产物,作为一种重要的有机酸广泛用于食品、医药、精细化工等领域.为提高L-氨基酸脱氨酶全细胞催化法合成α-KG的效率及产量,首先通过优化全细胞催化剂制备条件及全细胞转化反应条件,包括发酵过程中的温度、诱导剂浓度、诱导剂添加时刻、诱导时间等;全细胞转化过程中的温度、pH、细胞量、转化时间.各个条件优化后以200g/L谷氨酸钠为底物时,产量最终提高了54.9％,摩尔转化率为39.6％.其次,通过定点饱和突变对L-氨基酸脱氨酶进行定向进化以提高其催化能力.经过多次突变、筛选,最优突变体E.coli BL21-pET-20b(+)-pml152催化200g/L谷氨酸钠生成α-KG最高产量为100.9g/L,摩尔转化率为64.7％,较最初对照菌株提高了66.3％.结果表明,条件优化和饱和突变可有效提高重组大肠杆菌全细胞转化合成α-KG的能力.

目的 比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase,PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案.方法 以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase,ECAP)与PAAS融合表达质粒为模板,分别用针对PAAS目的位点的随机引物、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库;碱裂解细胞后高通量测定PAAS突变体与ECAP活性比值进行筛选,比较3种定点饱和突变建库方案需筛选的单克隆数量、所获突变体种类、整体耗时、整体成本及影响因素.结果 用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体,但对G138位定点饱和突变未见明显的密码子偏好性且筛选不到150个单克隆获得18种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体.单个精确引物逐个PCR实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数最少,总耗时和总成本最低;相比之下,用随机引物和精确引物等量混合物实施定点饱和突变时,所需筛选的单克隆数、整体耗时及成本均显著增加.结论 解析序列-活性关系时,用单个精确引物逐个PCR实施定点饱和突变有显著整体成本和效率优势;仅筛选阳性突变体时,用精确引物等量混合物进行PCR建库在成本和效率上更有优势.