目的:探讨血管性血友病因子裂解酶ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1型13(ADAMTS13)间隔区结构域在血管性血友病因子(vWF)裂解过程中的生物学功能,阐明ADAMTS13在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)发病机制中的作用.方法:将ADAMTS13间隔区结构域中的氨基酸残基TEDRLPR以点突变技术逐个基因突变(突变体M1～M7),将构建的ADAMTS13与其突变体质粒转染至人胚肾HEK293细胞,稳定表达后提纯重组蛋白.观察野生型和突变型ADAMTS13在变性条件、剪切应力作用和ADAMTS13抗体处理后裂解vWF的能力.结果:荧光共振能量转移(FRET)实验,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)对FRET-vWF73剪切能力降低(P＜0.05).变性条件下,野生型ADAMTS13可以将vWF多聚体裂解,与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)的裂解活性明显降低(P＜0.01).在体外剪切应力作用下,与野生型 ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体 M4(R635A)和突变体M7(R638A)裂解vWF多聚体的能力明显降低(P＜0.01).与野生型ADAMTS13比较,ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)与vWF之间的结合力差异无统计学意义(P＞0.05),表明ADAMTS13的C末端与vWF之间存在多个结合位点.ADAMTS13抗体处理可在一定程度上抑制野生型和突变型ADAMTS13裂解vWF的能力.结论:间隔区突变后ADAMTS13的活性降低.ADAMTS13突变体M4(R635A)和突变体M7(R638A)可能是ADAMTS13在底物识别时的重要作用位点.

目的 研究温经通络汤含药血清对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的小鼠原代软骨细胞损伤的影响及机制.方法 采用IL-1β诱导小鼠原代软骨细胞损伤模型,检测细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α,软骨降解相关蛋白酶基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9、MMP13、ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白 1 基元 4(ADAMTS4)以及糖酵解相关酶乳酸脱氢酶A(LDHA)、M2 型丙酮酸激酶(PKM2)、还原型辅酶Ⅱ氧化酶 2(NOX2)、还原型辅酶Ⅱ氧化酶 4(NOX4)的 mRNA 表达;测定细胞内MMP3、MMP13、P65、IκB-ζ、缺氧诱导因子 1α(HIF-1α)以及LDHA蛋白表达水平;进一步检测细胞上清液中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和乳酸的浓度,测定细胞内辅酶Ⅰ(NAD)的还原态(NADH)和氧化态(NAD+)的比率,以及细胞内活性氧(ROS)水平.结果 温经通络汤含药血清可显著抑制IL-1β软骨细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达(P＜0.01),降低细胞上清液中NO浓度(P＜0.05,P＜0.01),下调IκB-ζ(P＜0.05)和P65 蛋白表达(P＜0.05,P＜0.01).温经通络汤含药血清可显著下调MMP3、MMP9、MMP13 以及ADAMTS4 mRNA表达(P＜0.01),抑制MMP13(P＜0.05,P＜0.01)和MMP3(P＜0.05)的蛋白表达.氧化应激方面,它可显著抑制软骨细胞内ROS的产生,提高NADH/NAD+比率,降低上清液中MDA浓度,下调HIF-1α蛋白表达(P＜0.01).温经通络汤含药血清可显著降低乳酸浓度,下调LDHA、PKM2、NOX2、NOX4 的表达,降低细胞内糖酵解水平(P＜0.05,P＜0.01).结论 温经通络汤含药血清可通过抑制炎症、软骨降解、氧化应激和糖酵解,缓解IL-1β诱导的小鼠原代软骨细胞损伤,其机制可能与调控IκB-ζ/HIF-1α/LDHA轴有关.