CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具.其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达.作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域.随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了 gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力.基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性.

目的:探讨16p12.2拷贝数变异的产前超声和遗传学诊断。方法:回顾性分析2017年1月至2021年12月在福建医科大学附属福州市第一医院行产前诊断的7例16p12.2微缺失/重复胎儿的产前诊断指征、产前超声表现、染色体核型、遗传学分析、变异溯源、妊娠结局及出生后随访情况等。对数据进行描述性统计分析。结果:3例为产前超声结构异常，包括多发畸形、室间隔缺损及唇腭裂各1例；其余4例为涉及心脏和肾脏的软指标异常。7例胎儿染色体核型分析均未见异常。单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）检测结果显示，4例16p12.2（远端）微缺失病例缺失的片段大小为381.7～542.4 kb，均包含 OTOA、 METTL9和 IGSF6等3个在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）基因；另3例16p12.2（近端）微缺失/重复的片段大小为484.0～701.7 kb，均包含 UQCRC2、 CDR2、 EEF2K和 POLR3E等4个OMIM基因。7例16p12.2微缺失/重复病例中，5例（例1、2、4、5、6）变异遗传自表型正常的母亲/父亲，其中3例（例2、4、5）足月分娩，出生情况正常；2例（例3、7）拒绝行家系验证。例3足月分娩，3个月行室间隔缺损修补术，随访至18个月未见明显异常。 结论:16p12.2区域微缺失/重复胎儿产前缺乏特异性表型。 OTOA基因是16p12.2远端区域异常关键基因。家系比对有助于减少不必要的主动终止妊娠。

目的:设计一台专用于兔尿道瘢痕的超声治疗仪，旨在验证此仪器的适用性及有效性。方法:以新西兰雄兔为实验对象，针对其阴茎结构与尺寸对超声治疗仪进行特制，此超声治疗仪包括超声脉冲发射与控制系统、末级功放和超声探头。首先，针对兔阴茎尺寸及结构对超声探头进行设计，并通过COMSOL有限元仿真以及声场分布实际测试等确定超声探头的参数；其次，根据超声探头元件参数设计其驱动电路；然后，设计基于现场可编程门阵列（FPGA）和串口屏的超声脉冲发射与控制系统；接着，对整体完成的超声治疗仪进行整体性能测试和安全测试；最后，构建兔尿道重建模型，将8只白兔随机分为模型组和实验组，实验组立即接受该超声治疗仪对其尿道部位的治疗，参数设置为超声频率2 MHz，脉冲间隔10 ms，输出声强0.73 W/cm 2。治疗频率为2次/周（周二、四），每次照射10 min，持续4周；模型组则不接受任何治疗，用Image J软件对兔尿道组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）染色阳性区域的面积占比进行定量分析，并计算尿道周长。 结果:添加了吸声材料的结构治疗腔内声压分布较为均匀，驻波比均值为1.11，结构设计满足设计期望。整体性能测试中3枚超声换能器自然焦点位置均为10 mm，声场分布一致性满足实验要求。各换能器峰值声压与电源电压关系接近线性。输出声强范围为0.35～0.74 W/cm 2，满足实验要求。随着超声输出，测试点温度缓慢升高，此实验最高可使组织温度升高3.3 ℃，不会导致组织热损伤发生。动物实验表明，实验组兔尿道组织中TGF-β1免疫阳性面积分数[（4.21±1.32）%]小于模型组[（8.53±3.43）%]（ t＝?4.24， P<0.001）；实验组兔尿道组织中TNF-α免疫阳性面积分数[（5.14±2.72）%]小于模型组[（7.23±1.57）%]（ t＝?3.37， P<0.05）；实验组兔尿道组织中MMP-2水平[（10.65±2.24）%]高于模型组[（6.98±2.74）%]（ t＝2.19， P<0.05）；尿道周长[（12 209±2 743）μm]高于模型组[（10 127±2 237）μm]（ t＝15.46， P<0.05）。 结论:成功设计了一台专用于兔尿道瘢痕的超声治疗仪，可用于超声对兔尿道瘢痕治疗的研究。

患者男，27岁。因右眼突然视力下降2 d于2020年11月23日到南京医科大学附属眼科医院就诊。患者全身情况良好，既往无高血压、糖尿病全身病史；有多次高海拔地区活动史，每次间隔1~2年，最高约至4 500 m，未发现任何不良反应。2020年11月17日患者徒步攀登海拔5 500 m的雪山，期间无明显不适，3 d后返程，于半日内下降至海拔3 000 m城市，约1 h后右眼视力突然下降。眼科检查：右眼、左眼最佳矫正视力（BCVA）分别为0.5、1.0。双眼眼前节正常。眼底检查，右眼黄斑区及中周边视网膜、左眼上方血管弓周围小片状出血（图1）。荧光素眼底血管造影（FFA）检查，双眼颞侧周边毛细血管扩张，晚期轻微荧光着染及荧光素渗漏；右眼黄斑中心凹旁及左眼上方血管弓旁散在小片出血遮蔽荧光（图2）。多焦视网膜电图（mf-ERG）检查，右眼黄斑区尖峰不明显，周边可见凹陷区，中心凹及旁中心凹反应密度均有不同程度下降，后极部区域反应密度降低（图3A）；左眼正常。微视野检查，右眼黄斑区平均阈值降低（图3B）；左眼正常。光相干断层扫描血管成像（OCTA）检查，右眼黄斑区视网膜层间出血，中心凹偏颞下方深层视网膜局部可见片状中等反射（图3C）；左眼黄斑区视网膜结构尚可。血常规及血凝指标检查结果均正常。诊断：（1）双眼高原视网膜病变（HAR）；（2）双眼视网膜出血。予以口服改善微循环及营养神经药物治疗。

目的:探讨乳糜脂肪在眼睑贴骨瘢痕性凹陷萎缩畸形治疗中的应用效果及合理的治疗策略。方法:回顾分析2017年3月至2019年5月，中国医学科学院整形外科医院收治的符合入选标准的眼睑贴骨性瘢痕所致的凹陷及萎缩畸形患者的临床资料。首先行腹部皮下脂肪抽吸，将获取的脂肪进一步机械细化处理获得乳糜脂肪。根据需要在眼眶区域行序列化乳糜脂肪注射，每次注射间隔时间约3个月。脂肪移植后3个月左右，对于伴发上睑下垂或眦点异位行必要的对症处理，对于下睑则联合眼轮匝肌肌皮瓣治疗修复眼睑畸形。术后定期随访，观察并发症出现情况。治疗结束后6个月，采用患者和观察者瘢痕评价量表(POSAS)评估瘢痕，同时使用医患综合评分评估患者满意度。结果:共入选6例眼睑区域贴骨瘢痕患者，男4例，女2例，年龄24～53岁，平均37岁。缺损原因：外伤4例，上颌骨骨髓炎治疗后2例。病程时间：1.5～50.0年，平均14.2年。瘢痕位置：上睑4例，下睑2例；凹陷区域面积：0.5 cm×2.0 cm ～1.5 cm×3.0 cm。上睑乳糜脂肪注射3～4次，平均3.25次；下睑平均2次，单次注射量0.6～1.3 ml，注射总量1.4～2.7 ml。治疗结束后6个月，所有患者外观显著改善，眼睑软组织容量明显增加，瘢痕区域组织活动度良好、弹性改善，无并发症出现。患者自评量表(PSAS)和观察者评分量表(OSAS)分数分别为(7.0±1.0)分和(6.7±1.1)分，医患综合评分为4～5分，平均4.5分。结论:对于上睑贴骨瘢痕性凹陷萎缩，乳糜脂肪能够有效增加组织容量，治疗效果良好；对于下睑，则需要在乳糜脂肪移植的基础上联合眼轮匝肌肌皮瓣，进一步增加支持结构，方可获得较好的重建外观。

目的:探讨TBX20基因突变与先天性心脏病的关系，探索先天性心脏病发生的分子生物学机制。方法:收集2017年8月至2019年7月在山西省儿童医院心胸外科确诊的353例中国汉族先天性心脏病患儿的临床资料作为观察组，其中男206例，女147例；中位年龄为1岁9个月，年龄范围为0~13岁，以同期门诊体检健康儿童350例为对照组，提取基因组DNA。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增编码TBX20基因的外显子以及外显子内含子交界区并进行测序分析。分别应用SIFT、PolyPhen2和Mutation Taster软件和PrDSM模型集成软件对发现的错义突变和同义突变进行致病性预测。结果:研究发现2个新错义突变，2个新同义突变。在1例完全性肺静脉异位引流合并房间隔缺损的患儿中发现新错义突变c.361A>T（I121F）；在1例法洛氏四联症合并卵圆孔未闭和动脉导管未闭的患儿中发现新错义突变c.785C>T（T262M）。在1例房间隔缺损合并不完全性右束支传导阻滞的患儿中发现新同义突变c.666C>T（N222N）；在1例法洛氏四联症合并卵圆孔未闭的患儿中发现新同义突变c.786G>C（T262T）。这些变异在对照组儿童中均未检测到。I121F、T262M、N222N、T262T均位于高度保守的T-box DNA结合结构域内。致病性预测表明除T262T致病可能较小外，I121F、T262M和N222N均为致病性突变，影响蛋白质功能。结论:TBX20基因突变在中国儿童先天性心脏病房间隔缺损、法洛氏四联症、完全性肺静脉异位引流的发病机制中可能发挥着重要作用。这一发现首次将TBX20基因突变与完全性肺静脉异位引流疾病联系起来，拓宽了TBX20基因突变的疾病谱。

目的:分析11例22q11.2区域微重复胎儿的产前诊断结果及出生后表型特征。方法:2016年1月至2020年2月在杭州市第一人民医院进行产前诊断、染色体核型以及染色体微阵列分析（CMA）者共2 969例，结果为22q11.2区域微重复胎儿共11例。对胎儿表型、遗传学结果、妊娠结局及出生后临床表现进行回顾性分析。结果:11例胎儿在22q11.2区域内有经典的3.0 Mb微重复［即腭面心综合征（DiGeorge and velocardiofacial syndromes，DGS/VCFS）］6例、1.5 Mb近端微重复1例及远端小片段微重复4例。家系遗传背景：遗传7例，新发2例，未验证（拒绝验证）者2例。胎儿超声检查显示：结构异常2例（室间隔缺损和无脑儿），胎儿生长受限2例，无结构异常7例。妊娠结局：引产4例，其中2例为产科筛查高风险、经典的3.0 Mb微重复、超声检查未见异常，1例为高龄、经典的3.0 Mb微重复、超声检查诊断为胎儿生长受限，1例为胎儿超声检查异常、远端小片段微重复、超声检查无脑畸形；足月分娩7例（经典的3.0 Mb微重复3例、1.5 Mb近端微重复1例及远端小片段微重复3例），出生后均进行随访，异常表型3例（生长发育落后等），无明显异常表型4例。结论:22q11.2微重复胎儿的临床表型无特异性，出生后表型多样，需加强专业遗传咨询和长期随访，孕妇及其家属需充分了解可能出现的临床表型并做出知情选择。

目的:采用全基因组测序对南京"5.7" 192Ir源事故患者外周血及组织进行照后第2 047天(5年7个月零7天)基因变异分析，探讨其电离辐射引起的体细胞变异情况，为明确电离辐射引起的远后效应提供理论依据。 方法:收集南京"5.7" 192Ir源事故患者王某照后第2 047天的背部正常皮肤组织、受照射范围内的骨及软组织、外周血3种样本，分别提取DNA后采用全基因组测序技术对样本进行高通量测序，并通过生物信息学对原始测序数据进行分析。以背部正常皮肤组织为对照，开展受照射范围内的骨及软组织、外周血的基因变异检测分析。 结果:与背部正常皮肤组织相比，受照射范围内的骨及软组织和外周血的基因组出现了多种基因变异，包括碱基置换(碱基转换、碱基颠换)、小片段插入、小片段缺失、拷贝数变异(拷贝数增加、拷贝数减少)以及结构变异(大片段缺失、大片段重复、倒位、染色体内易位以及染色体间易位)，受照射范围内的骨及软组织出现10 666个基因变异，外周血出现11 233个基因变异，变异DNA涉及上万个基因。这些基因变异存在于外显子、内含子、3'UTR(3'untranslated region，3'端非编码区)、5'UTR(5'untranslated region，5'端非编码区)、剪切位点附近、转录起始位点上游5 kb区域以内、转录终止位点下游5 kb区域以内、非编码RNA以及基因间隔区域，且所有染色体都存在基因变异。结论:南京"5.7" 192Ir源放射事故患者照后第2 047天受照射范围内的骨及软组织和外周血中存在大量的基因变异，可能影响机体的功能及电离辐射诱发的远后效应。

目的:观察并初步探讨黄芪甲苷（AS-A）干预碘酸钠（NaIO 3）诱导的光感受器退行性病变的效应及相关机制。 方法:6~ 8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠60只，随机分为正常对照组（NC组）、NaIO 3组、AS-A组，每组20只。建模前30 min，AS-A组按100 mg/kg的剂量腹腔注射100 μl AS-A；30 min后，NaIO 3组、AS-A组小鼠按30 mg/kg的剂量腹腔注射100 μl NaIO 3。其后，AS-A组小鼠每天早晚间隔12 h给药2次，直到实验结束。建模后1 d，紧密连接蛋白（ZO-1）染色观察视网膜色素上皮（RPE）细胞结构；实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测各组小鼠视网膜趋化因子配体2 （ Ccl2）、白细胞介素1β （ Il-1β）、混合谱系激酶结构域样蛋白（ Mlkl）、受体相互作用蛋白激酶3 （ Ripk3）、肿瘤坏死因子（ Tnf）等基因的mRNA相对表达量。建模后3 d，免疫组织化学染色观察各组小鼠视网膜中离子钙接头蛋白1 （Iba1）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性表达；原位末端标记（TUNEL）法检测各组小鼠视网膜光感受器细胞的死亡情况。建模后4 d，采用眼底彩色照相、光相干断层扫描（OCT）检查观察各组小鼠眼底形态；苏木精-伊红染色（HE）观察各组小鼠视网膜形态结构。两组间比较采用独立样本 t检验；三组间比较采用单因素方差分析。 结果:眼底彩色照相、OCT检查发现，NaIO 3组小鼠眼底可见大量散在黄白色玻璃膜疣样结构，RPE层出现大量强反射区；AS-A组RPE层中强反射区数量减少。ZO-1染色结果显示，NaIO 3组RPE细胞膜上ZO-1大量丢失；AS-A组ZO-1均匀分布于RPE细胞膜上。HE染色结果显示，NaIO 3组RPE层可见圆形黑色沉积物，光感受器内外节结构严重受损，外核层（ONL）细胞层核数显著减少；AS-A组RPE层色素整齐，光感受器内外节结构完整，ONL细胞核层数显著增加。TUNEL检测结果显示，NaIO 3组ONL可见大量TUNEL阳性细胞核，AS-A组视网膜ONL中TUNEL阳性细胞核数量显著减少，差异有统计学意义（ t=2.66， P<0.05）。qPCR检测结果显示，与AS-A组比较，NaIO 3组视网膜中 Mlkl、 Ripk3、 Ccl2、 Il-1β、 Tnf mRNA相对表达量显著升高，差异有统计学意义（ F=39.18、10.66、53.51、41.40、24.13， P <0.001）。免疫组织化学染色结果显示，与NC组、AS-A组比较，NaIO 3组视网膜中GFAP阳性表达显著升高，差异有统计学意义（ F=9.62， P<0.05）。 结论:AS-A能有效抑制NaIO 3诱导的光感受器退行性病变，其效应部分与抑制光感受器死亡和神经炎症反应，维护视网膜稳态相关。

目的:探讨结核菌素（PPD）与结核感染T细胞斑点试验阳性的匐行样脉络膜炎（PTP-SLC）患者临床及眼底影像学特征及其与普通匐行性脉络膜炎（SC）的鉴别。方法:回顾性系列病例研究。收集2015年11月至2017年11月在首都医科大学附属北京同仁医院就诊的PTP-SLC患者13例（21只眼），其中男性8例（14只眼），女性5例（7只眼）；年龄（45±12）岁。对患者进行病史、全身及眼科检查结果资料的采集，分析患者眼底自发荧光照相、相干光层析成像术（OCT）、荧光素眼底血管造影（FFA）及吲哚青绿脉络膜血管造影（ICGA）等眼底影像学资料并进行总结。结果:13例PTP-SLC患者中男女比例8∶5。其中双眼发病者8例，其双眼发病时间的间隔为（8.4±7.9）年。患者平均视力0.3，其中4例患者有明确的结核病接触史。PTP-SLC患者眼底活跃期病灶主要表现为，质地均匀边界不清的淡黄色病灶。自发荧光为弥漫边界不清的高自发荧光。OCT可见活动病灶区域脉络膜基质间点状高反射，视网膜外层结构破坏，伴层间水肿。玻璃体腔内还可见点状高反射。FFA早期示活跃期病灶呈弱荧光，晚期病变呈弥漫高荧光伴有渗漏。ICGA表现为持续的弱荧光灶。结论:PTP-SLC眼底病变主要表现为质地均匀边界不清的淡黄色高自发荧光病灶，OCT可见脉络膜及视网膜外层结构受累，FFA可以发现更多视网膜血管炎性改变。仅根据临床特征和流行病学特征很难区分PTP-SLC与SC，结核病原学检查结果仍是鉴别诊断的关键。 （中华眼科杂志，2020，56：914-919）