目的:探讨β-分泌酶反义核糖核酸(BACE1-AS)对血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)诱导的心肌细胞损伤的影响及其机制。方法:Ang Ⅱ处理H9c2心肌细胞(购自中国科学院上海细胞库)建立心肌细胞损伤模型，H9c2心肌细胞培养液中加入Ang Ⅱ建立心肌细胞损伤模型(Ang Ⅱ组)，同时将正常培养的心肌细胞作为对照(Con组)。分别将干扰对照序列(si-NC)、干扰BACE1-AS序列(si-BACE1-AS)、抑制剂阴性对照序列(anti-miR-NC)、Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS与miR-137抑制剂(anti-miR-137)转染至心肌细胞，加入含有浓度为1 μmol/L Ang Ⅱ的培养液继续培养48 h，分别记作Ang Ⅱ＋si-NC、Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS、Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS＋anti-miR-NC、Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS＋anti-miR-137组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测BACE1-AS、微小RNA-137(miR-137)的表达水平；检测乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量；流式细胞术检测细胞凋亡率；双荧光素酶报告实验检测BACE1-AS和miR-137的靶向关系；蛋白质印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(bcl-2)和bcl-2相关X蛋白(bax)表达。两组间比较采用 t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK- q检验。 结果:与Ang Ⅱ＋si-NC组比较，Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS组凋亡率显著降低[(14.83±2.28)%比(27.84±1.54)%， t＝28.137， P<0.05]，bax蛋白水平显著降低(0.64±0.10比0.97±0.02， t＝40.627， P<0.05)，bcl-2蛋白水平显著升高(0.68±0.05比0.33±0.04， t＝19.032， P<0.05)，差异均有统计学意义。双荧光素酶报告实验证实BACE1-AS可靶向结合miR-137。Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS＋anti-miR-137组miR-137、SOD和bcl-2水平低于Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS＋anti-miR-NC组(0.36±0.11比0.99±0.01、21.18±1.66比32.85±2.98、0.38±0.08比0.68±0.04， t＝17.111、10.263、10.062， P<0.05)，LDH、MDA、凋亡率和bax水平高于Ang Ⅱ＋si-BACE1-AS＋anti-miR-NC组(377.03±2.75比323.52±20.71、30.80±2.56比18.06±0.58、23.04±2.55比14.80±0.35、0.88±0.04比0.63±0.05， t＝7.684、14.561、9.604、11.713， P<0.05)，差异均有统计学意义。 结论:敲低BACE1-AS表达可通过上调miR-137的表达来减轻Ang Ⅱ诱导的心肌细胞损伤。

目的:探讨MPTP对小鼠多巴胺能神经元细胞MN9D凋亡的影响及其可能机制.方法:MN9D细胞分别以0、1 μmol/L MPTP处理(对照组和MPTP组),或分别以pcDNA4、pcDNA4-BACE2 转染(对照组和BACE2 组),采用Western blot法检测BACE2、Cleaved Caspase-3 和内源性DSG2 蛋白的表达.MN9D细胞分为DSG2 组、DSG2 + BACE2 组和DSG2 +BACE2 +BACE抑制剂组,分别转染pENTER-DSG2 +pcDNA4、pENTER-DSG2 +pcDNA4-BACE2以及转染pENTER-DSG2 +pcDNA4-BACE2 后用1 μmol/L的BACE抑制剂处理,采用Western blot法检测DSG2 全长以及DSG2 各片段的表达.结果:与对照组相比,MPTP组中BACE2 及Cleaved Caspase-3 表达均上升(P<0.05);与对照组相比,BACE2 组Cleaved Caspase-3 表达增加,内源性DSG2 表达减少(P<0.05).与DSG2 组相比,DSG2 + BACE2 组中全长DSG2 表达下降,DSG2 羧基末端片段以及胞外DSG2 氨基末端片段均增多(P<0.05),而DSG2 + BACE2 +BACE抑制剂组中全长DSG2 及各DSG2 片段的表达与DSG2 组相似(P>0.05).结论:MPTP可通过上调BACE2 促进MN9D细胞凋亡,其机制可能与BACE2 对DSG2 的剪切有关;BACE2 和DSG2 可能参与了帕金森病的发病.

目的:通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,以β淀粉样蛋白(Aβ)为切入点,研究其在模型的表达以及与神经元凋亡的关系,探讨 Aβ在新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型中对神经元的作用及机制.方法:建立10 日龄新生大鼠缺血性脑损伤模型,模型后 2、4、8、24 h 心脏灌注,分别检测脑组织中 Aβ、脑内淀粉样前体蛋白(APP)、β-分泌酶(BACE1)、Caspase-3、Cleaved caspase-3、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的蛋白表达,BACE1 的 mRNA 表达.使用BACE1 抑制剂干预,实验分为三组,缺氧缺血组、抑制剂组和溶剂组,抑制剂组在缺氧缺血后即给予BACE1 抑制剂 AZD3293 处理 24h后再次检测以上指标.结果:APP、Aβ的蛋白表达、BACE1 的蛋白表达和 mRNA水平在建模后呈时间依赖的上升,24 h达到高峰.同时,促凋亡蛋白Cleaved caspase-3 在建模后也呈时间依赖的上升,24 h达到高峰.而在缺氧缺血 2h 后,凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的蛋白水平显著升高(P<0.05).之后逐渐降低,24h最低.当使用BACE1 抑制剂后,Aβ及BACE1 在脑组织中的表达显著下降(均P<0.05),而BACE1 mRNA的表达没有变化(P>0.05).同时促凋亡蛋白Cleaved caspase-3 的表达明显下降(P<0.05),同时,Bcl-2 蛋白的表达也显著升高(P<0.05).结论:在新生鼠 HIBD时 Aβ产生增多,应用 BACE1 抑制剂可降低 Aβ的表达,增加 Bcl-2的表达,减轻神经元凋亡.

患者 男,68岁.突发胸痛伴胸闷、咳嗽急诊收入院.胸部强化CT显示右肺上叶靠近肺门肿块影,大小约6.3cm×6.0cm,呈轻度不均匀强化,分期为cT4N1Mx(图1).查体及一般情况无异常.

目的 探索阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)患者血清差异表达的miRNAs及其与认知功能的关系.方法 采用lllumina/Solexa高通量测序技术分析AD患者和健康体检老年人两组(各30例)血清miRNA表达谱;构建miRNA慢病毒质粒,注射至造模成功的AD大鼠静脉内,采用水迷宫实验分析大鼠的认知功能;合成miRNA模拟剂(mimics)、抑制剂(inhibitor),转染至SH-SY5Y细胞系中,采用Western blot法检测细胞中β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)的表达.结果 与正常对照组(control)相比,AD组血清中miR-146a-5p(log2 AD/Control=2.3)、miR-195-5p(log2 AD/Control=10.2)、miR-20b-5p(log2AD/Control=15.1)表达上调,miR-19b-3p(log2AD/Control =-8.0)、miR-125b-3p(log2AD/Control=-15.3)表达下调,差异有统计学意义(P＜ 0.05);与AD组[(26.50±3.12)s]相比,AD+miR-19b-3p组[(15.33± 2.78)s]的大鼠逃避潜伏期明显缩短,差异具有统计学意义(P＜0.05);与正常对照相比,miR-19b-3p模拟剂组BACE1蛋白表达减少,抑制剂组BACE1蛋白表达增加.结论 miR-19b-3p可能通过调节BACE1的表达改善AD患者的认知功能.

目的:改进verubecestat的制备工艺.方法:以对甲氧基苯甲醛为起始原料通过10步反应合成了BACE(β-淀粉样前体蛋白水解酶)抑制剂verubecestat(N-｛ 3-[(SR)-2H-1,1-二氧代-2,5-二甲基3-氨基-5,6-二氢-1,2,4-噻二嗪基]4-氟苯基}-5-氟-2-吡啶甲酰胺).结果:目标产物经1H-NMR和ESI-MS确认结构正确.结论:改进后的制备工艺反应条件温和,适合于实验室研究的小规模制备.

本文在先前的虚拟筛选发现的命中化合物B51 (IC50 =37.4 μM)的结构基础上,设计并合成了一系列新型甲基异噁唑/异噻唑衍生物类BACE1抑制剂.分子对接结果显示,将B51结构中的氰基嘧啶酮片段转化为甲基异恶唑/异噻唑,同时缩短连接氰基嘧啶酮环和酰胺键另一侧咪唑环之间的连接链长度,可以使分子与BACE1的S1'和S2'口袋的契合程度更好,从而提高活性.因此本文设计合成了20个甲基异噁唑/异噻唑类衍生物并对其抑制BACEl酶活性进行了初步构效关系研究.在这些化合物中,5t显示出比B51提高了近10倍的效力.SPR实验结果显示,其与BACE1结合动力学呈现“快结合,慢解离”的特征.所获得的活性甲基异噻唑类化合物分子量小,对正常细胞安全无毒,经PAMPA实验测试具有透过BBB的可能,可作为BACE1抑制剂类抗AD药物设计的新结构骨架.

目的:为新型高效联芳基氨基噻嗪类β-淀粉样前体蛋白水解酶1(BACE1)抑制剂的设计合成与新型AD治疗药物研发提供理论基础.方法:选取41个联芳基氨基噻嗪类BACE1抑制剂分子,运用SYBYL-X 2.0软件包,以比较分子场分析法(CoMFA)与比较分子相似性指数分析法(CoMSIA)构建该类衍生化合物的三维定量构效关系(3D-QSAR)模型,并以Surflex-dock分子对接方法分析该类化合物与BACE1的结合模式.结果:以CoMFA法和CoMSIA法构建的3D-QSAR模型的交叉验证系数(q2)均大于0.5,表明其预测能力良好;所建三维等势图能直观反映不同位置引入取代基对化合物活性的影响.Surflex-dock对接分析显示,联芳基氨基噻嗪类分子与BACE1中的ASP80、ASP276、TYR246等氨基酸残基具有氢键作用.结论:基于联芳基氨基噻嗪类衍生化合物所构建的3D-QSAR模型具有良好的预测能力,可指导该类化合物的结构优化;TYR246可能是联芳基氨基噻嗪类抑制剂化合物分子与BACE1结合的另一潜在活性功能残基.通过3D-QSAR分析与分子对接,可进行新型高效联芳基氨基噻嗪类BACE1抑制剂的设计合成,进而用于研发新型AD治疗药物.

目的 探讨DMT1抑制剂ebselen是否通过抑制细胞内铁离子内流, 发挥抑制Aβ产生的作用.方法 培养APPsw细胞, MTT法检测ebselen对细胞活力的影响, 分别给予FeSO4或ebselen处理细胞, ELISA检测Aβ1-42水平, 免疫荧光检测DMT1和BACE1的表达, 以及荧光分光光度计检测ebselen对二价铁离子转运的影响.结果 ebselen作为DMT1抑制剂, 能抑制二价铁离子的细胞内转运, 降低DMT1和BACE1的表达水平, 抑制铁诱导的APPsw细胞内Aβ1-42水平.结论 ebselen抑制铁诱导的APPsw细胞内Aβ1-42水平, 从而抑制Aβ的产生.

天冬氨酰蛋白酶(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,BACE1)作为治疗阿尔兹海默症的潜在靶点,其抑制剂的开发已成为医学领域的重要研究方向.本文以59个氨基恶唑啉咕吨类BACE1抑制剂为研究对象,运用比较分子相似性指数(comparative molecular similarity index,CoMSIA)和分子对接方法,深入挖掘影响抑制剂活性的特征结构,以及抑制剂与BACE1间的结合模式和作用力类型,并以此为基础设计新型抑制剂并预测其活性.CoMSIA模拟结果表明,由立体场、静电场、疏水场和氢键供体场4个场组合建立的构效关系模型具有较强的预测能力,交叉验证相关系数Q2=0.48,非交叉验证相关系数Rncv2 =0.94,外部预测相关系数尺pre2=0.85;通过分子对接,发现抑制剂占据了靶标的S3、S1和S2'位点,与BACE1之间的结合主要是通过氢键作用力和π-π堆积作用实现的;占据S2'位点的R取代基是立体场、静电场和疏水场影响的敏感区域,氨基恶唑啉核心官能团是氢键供体场的敏感区域.基于以上分析获得的抑制剂特征结构信息及其与蛋白质受体的作用机制,成功设计出了新的分子并预测了抑制活性.实验所得模型和信息,为后续新型BACE1抑制剂的结构优化和改造提供了重要理论依据.