目的:探讨Kruppel样转录因子6(KLF6)基因调控谷氨酰胺酶2(GLS2)对人肝癌细胞系Bel7404、Huh7增殖的影响。方法:采用定量聚合酶链反应(qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测正常肝细胞和肝癌细胞中KLF6的mRNA和蛋白表达(上海细胞库)。沉默KLF6基因，细胞计数试剂盒(CCK-8)和细胞增殖实验(EdU)检测细胞增殖；结合前期实验基础、转录因子结合位点数据库(JASPAR)辅助筛选KLF6结合GLS2结合序列；染色质免疫共沉淀(CHIP)验证转录因子KLF6结合GLS2的序列；qPCR、Western blot检测沉默KLF6，GLS2的mRNA和蛋白的表达量。结果:KLF6在人肝癌细胞系HepG2(0.12±0.01)、HepG3B(0.11±0.02)、BEL-7404(0.44±0.02)、Huh7(0.34±0.03)中mRNA表达低于正常细胞HL7702(1.00±0.01)，具有统计学意义( t＝172.80、113.90、61.64、44.41， P<0.01)；Western blot检测KLF6在HepG2(0.57±0.02)、HepG3B(0.53±0.01)、BEL-7404(0.73±0.01)、Huh7(0.66±0.01)中蛋白表达水平低于HL7702，差异有统计学意义( t＝37.79、42.17、31.40、40.13， P<0.01)；沉默KLF6基因，CCK-8检测Huh7在0、24、48、72 h增殖能力(0.20±0.01、0.30±0.01、0.45±0.04、0.63±0.02)高于对照组(0.20±0.01、0.29±0.01、0.35±0.03、0.47±0.01)，差异有统计学意义( F＝43.46， P<0.01)；CCK-8检测Bel7404在0、24、48、72 h增殖能力(0.20±0.01、0.27±0.01、0.42±0.02、0.62±0.04)高于对照组(0.20±0.01、0.26±0.01、0.36±0.01、0.44±0.02)，差异有统计学意义( F＝141.40， P<0.01)；EdU检测Huh7中3个不同抑制剂sh-KLF6-1、sh-KLF6-2、sh-KLF6-3增殖率(56.83%、52.68%、45.43%)高于对照组(35.32%)，差异有统计学意义( t＝6.68、4.10、3.86， P<0.01)；同理检测Bel7404中3个不同抑制剂增殖率(53.61%、49.32%、42.16%)高于对照组(32.75%)，差异有统计学意义( t＝3.48、2.89、2.31， P<0.01)；沉默KLF6基因，Huh7细胞在3种不同抑制剂sh-KLF6-1、sh-KLF6-2、sh-KLF6-3中GLS2的mRNA表达(0.01±0.00、0.13±0.01、0.44±0.02)低于对照组(1.01±0.01)，差异有统计学意义( t＝94.63、23.54、27.04， P<0.01)；实验组蛋白表达(0.41±0.01、0.64±0.10、0.87±0.02)低于对照组(1.00±0.01)，差异有统计学意义( t＝15.11、9.57、3.88， P<0.01)；Bel7404细胞在sh-KLF6-1、sh-KLF6-2、sh-KLF6-3中GLS2的mRNA表达(0.04±0.01、0.29±0.10、0.33±0.02)低于对照组(1.00±0.01)，差异有统计学意义( t＝30.21、21.82、20.92， P<0.01)；实验组蛋白表达(0.36±0.01、0.66±0.10、0.72±0.02)低于对照组(1.00±0.01)，差异有统计学意义( t＝59.99、36.50、21.80， P<0.01)。 结论:KLF6介导的GLS2调控途径显著抑制肝癌细胞的增殖。

目的:探索环状RNA circDLG1在肝细胞癌(HCC)生物学进程中的作用。方法:通过利用公共数据库分析circDLG1在肝细胞癌肿瘤组织及正常组织的表达水平，并利用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)在细胞水平进行验证，qRT-PCR验证短发卡RNA(shRNA)转染效率，平板克隆实验分析circDLG1对HCC细胞增殖活力的影响。利用蛋白质印迹法(Western blot)和qRT-PCR检测circDLG1对HCC糖代谢相关葡萄糖的摄取、消耗、乳酸的产生和对索拉非尼耐药的影响。采用 t检验或单因素方差分析组间差异。 结果:GSE97332公共数据库分析表明circDLG1在肿瘤组织中的表达高于正常组织组(8.632±0.861比4.833±0.357， t＝6.482， P<0.05)。qRT-PCR结果表明circDLG1在肝细胞癌(SK-Hep-1、Huh7、HepG2、HepG3B和BEL7404组)中的表达量高于HCC空白对照组(3.358±0.325、8.297±0.557、5.624±0.571、4.028±0.534、6.488±0.386比1.566±0.136， t＝6.228、8.372、7.864、6.486、6.318、7.571， P<0.05， P<0.01)。qRT-PCR验证转染shRNA可以使circRNA DLG1在HCC细胞中的表达水平低于HCC空白对照组(Hep3B：0.324±0.028、0.487±0.034比1.155±0.244， t＝11.287、9.661， P<0.01；Huh7：0.283±0.016、0.425±0.024比1.117±0.486， t＝11.498、10.087， P<0.01)，平板克隆实验和生物化学实验结果表明敲低circRNA DLG1导致HCC细胞增殖低于HCC空白对照组(Hep3B：72.300±8.400、76.800±6.200比152.300±8.200， t＝10.287、9.053， P<0.01；Huh7：46.500±4.100、52.500±7.800比173.800±9.600， t＝20.384、16.343， P<0.01)、葡萄糖的摄取低于HCC空白对照组(Hep3B：138.942±10.133比98.323±7.922、68.669±7.924比109.355±7.654， t＝12.035、14.546， P<0.01；Huh7：125.671±6.772比105.372±6.338、50.379±6.114比99.364±6.449， t＝7.286、16.825， P<0.01)、细胞外酸化率低于HCC空白对照组(Hep3B：41.261±5.338比73.615±8.933， t＝8.068， P<0.01；Huh7：44.871±8.245比69.348±9.742， t＝10.323， P<0.01)及乳酸的产生低于HCC空白对照组(Hep3B：138.664±8.669比98.637±9.774、60.258±7.864比100.236±6.883， t＝16.825、7.286， P<0.01；Huh7：142.928±8.17比106.775±5.933、82.189±7.549比104.775±6.746， t＝18.148、6.972， P<0.01)以及对索拉非尼的耐药性低于HCC空白对照组(Hep3B：26.458±7.146比49.324±2.690， t＝6.065， P<0.05；Huh7：32.651±3.228比52.374±6.270， t＝6.828， P<0.05)。 结论:circDLG1可以促进肝细胞癌细胞的增殖、糖酵解及对索拉非尼的耐药性

目的 探讨减数分裂内切酶1(EME1)在肝癌组织中的表达及其对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 筛选TCGA数据库肝癌样本中的差异表达基因.采用免疫组化和Western Blot分析EME1在肝癌组织中的表达丰度.通过短发夹RNA(shRNA)构建慢病毒并感染BEL-7404细胞干扰EME1基因表达,分为沉默组(shEME1)和对照组(shCtrl).通过实时荧光定量PCR法和Western Blot检测两组EME1 mRNA和蛋白表达水平,Celigo计数法及MTT活性检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期,Caspase3/7活性检测细胞凋亡.两组间比较采用成组t检验.结果 TCGA结果显示EME1的mRNA表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的18.9倍(114.5±153.0 vs 8.0±7.2,t=5.00,P<0.001);EME1的蛋白表达水平在肝癌组织中是癌旁组织的7.0倍(免疫组化检测,8.4±2.6 vs 1.2±0.4,t=7.55,P<0.001)和2.5倍(Western Blot检测,249.0%±35.5%vs 100.0%±77.8%,t=3.02,P<0.05).慢病毒感染后,相对于对照组,沉默组EME1的mRNA表达水平下降了29.9%(29.9%±0.9%vs 100.0%±3.6%,t=32.82,P<0.001),蛋白表达水平显著下降了35.7%(35.7%±14.9%vs 100.0%±28.9%,t=3.42,P<0.05);细胞计数下降了45.1%(4 053±167 vs 8 988±477,t=16.91,P<0.001)、细胞活性下降至66.9%(0.518±0.046 vs 0.774±0.022,t=8.74,P<0.001)及细胞克隆形成能力下降至29.0%(75±6 vs 260±9,t=28.92,P<0.001).与对照组比较,沉默组G1期细胞(49.9%vs 44.0%,t=8.96,P<0.001)比例增多,G2/M期(15.9%vs 17.9%,t=9.13,P<0.001)与S期(34.2%vs 38.1%,t=6.91,P<0.001)的细胞比例减少;Caspase3/7活性增强了1.5倍(145.8%±5.9%vs 100.0%±2.3%,t=12.50,P<0.001).结论 EME1在肝癌组织中高表达,沉默EME1基因可抑制肝癌细胞增殖,促进细胞凋亡.

目的 通过验证 secoemestrin C(Sec C)对肝癌细胞增殖的影响,观察细胞内脂质过氧化水平,检测内质网应激(ERS)相关信号通路变化,进而揭示 Sec C 在抑制肝癌增殖过程中的作用机制,为针对肝癌的药物研发提供新的思路.方法 四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验和平板克隆法测定 Sec C对 HepG2 和 BEL7404 细胞增殖的影响;流式细胞术测定Sec C 对肝癌细胞脂质过氧化和凋亡的影响;Western blot法探究 Sec C 对肝癌细胞内质网应激和细胞凋亡相关蛋白表达的影响.结果 Sec C 以剂量依赖性方式抑制 HepG2 和 BEL7404细胞增殖,IC50 分别为 1.556 和 3.489 μmol/L;平板克隆实验结果显示,1 μmol/L Sec C 处理 7 d 后,肝癌细胞的克隆数目和大小显著降低,表明 Sec C 显著抑制肝癌细胞增殖且呈现浓度依赖.流式结果显示,与对照相比,Sec C 处理后,Bodipy 的阳性率增加且呈现浓度依赖,表明 Sec C促进肝癌细胞内脂质过氧化,且流式结果显示 Sec C 以剂量依赖性的方式诱导肝癌细胞凋亡.Western blot 结果表明,Sec C 会引起内质网应激相关蛋白免疫球蛋白结合蛋白、1 型内质网转膜蛋白激酶、活化转录因子 4 和磷酸化的真核生物起始因子 2 表达增多,其作用呈现浓度依赖性;同时 Western blot 结果显示,凋亡相关蛋白多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶的表达显著降低,以及凋亡剪切产物聚腺苷二磷酸核糖聚合酶、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶 7 的表达显著增多,其作用呈现浓度依赖性.结论 Sec C 能够显著抑制肝癌细胞的增殖,其作用机制可能通过诱导细胞内质网应激导致细胞凋亡.

目的 分别萃取鸡血藤的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂 4 个萃取部位来研究鸡血藤的抗肿瘤活性.方法 对鸡血藤进行提取,得到鸡血藤乙醇提取物后分别经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂进行萃取、浓缩后得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂 4 个部位浸膏,用CCK-8法检测这 4 个不同极性萃取部位对 3 种肿瘤细胞株人胃癌(SGC-7901)、人乳腺癌(MCF-7)、人肝癌(BEL-7404)体外生长的抑制作用,然后计算其半数抑制浓度(IC50)值.结果 4 个萃取物(石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂)对 3 种肿瘤细胞株的体外生长均有抑制作用,其中正丁醇萃取部位对 3 种肿瘤细胞的抗肿瘤活性最好,得到正丁醇萃取部位对人胃癌(SGC-7901)、人乳腺癌(MCF-7)、人肝癌(BEL-7404)细胞株的IC50 值分别为 0.08、0.29、0.21 mg/ml.结论 鸡血藤乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂萃取部位均具有一定的抗肿瘤作用,其中正丁醇萃取部位抗肿瘤活性最好,抗肿瘤效果要远远大于石油醚、乙酸乙酯和水溶剂 3 个部位.

目的 探讨紫檀芪(PTE)对肝细胞癌(HCC)的增殖和迁移能力的影响及其可能的机制.方法 培养人HCC细胞Hep3B、HepG2、Bel-7404、Bel-7402及永生化人肝细胞LO2,观察PTE对细胞生长能力的影响.MTT、平板克隆、EdU实验和Western-blot实验观察PTE对细胞增殖能力的影响.细胞划痕实验、Transwell实验和Western-blot实验检测细胞迁移能力的改变.应用过氧化氢(H2 O2)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18试剂盒分别检测H2O2、IL-1β和IL-18的表达水平.采用2,7-双乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)荧光探针孵育细胞,应用荧光酶标仪法检测ROS的表达水平.qRT-PCR和/或 Western-blot实验检测NOX4、NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的表达水平.免疫荧光染色方法检测NLRP3炎症小体的组装效应.结果 MTT、单克隆形成、EdU和Western-blot实验结果表明,PTE抑制HCC的增殖能力(P＜0.01).划痕实验、Transwell和Western-blot实验结果表明,PTE显著降低HCC的迁移能力(P＜0.01).PTE抑制Hep3B细胞中NOX4、ROS和H2O2的水平,且结果呈剂量依赖性(P＜0.01);予抗氧化剂NAC或NOX4抑制剂VAS2870处理后,细胞中ROS和H2O2水平进一步被抑制(P＜0.01).PTE呈剂量依赖性抑制Hep3B细胞中NLRP3炎症小体复合物组分NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β 的含量(P＜0.01);予 LPS 或 H2O2刺激后,Hep3B 细胞中 NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表达水平增加(P＜0.01),但上述结果可被PTE抑制(P＜0.01).免疫荧光结果表明,PTE抑制LPS诱导Hep3B细胞内NLRP3炎症小体的组装活化水平.MTT和Transwell实验结果表明,予LPS或H2O2刺激后Hep3B细胞增殖和迁移能力明显增加(P＜0.05),但上述结果可被PTE抑制(P＜0.05).结论 PTE通过抑制氧化应激和NLRP3炎症小体进而抑制HCC的增殖和迁移.

目的:观察外源锌对原发性肝细胞癌(HCC)BEL-7404细胞生物学行为的影响.方法:应用TSQ锌离子荧光探针、MTT法、DNA倍体法、吖啶橙/溴乙啶双荧光染色法和Transwell小室法分别检测不同浓度硫酸锌刺激下BEL-7404细胞内锌离子含量、细胞活力、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移和侵袭能力的变化.应用real-time PCR和Western blot法分别检测不同浓度锌离子对BEL-7404细胞白蛋白的mRNA和蛋白表达的影响.结果:随着培养环境中锌离子浓度的升高,BEL-7404细胞内的锌离子含量增加,细胞的存活率和细胞迁移与侵袭能力降低,凋亡率升高(P<0.05);G0/G1期细胞比例降低,G2/M期细胞比例升高(P<0.05);细胞白蛋白的mRNA和蛋白表达量增加(P<0.05).结论:外源性给予锌离子可抑制HCC细胞的活力、迁移与侵袭能力,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期在G2/M期,并可能降低细胞的恶性表型.

目的:探讨圆齿野鸦椿醇提物的抗肝癌活性.方法:制备圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物,采用MTT法体外检测这4种醇提物对人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721和BEL-7404的增殖抑制作用,流式细胞法检测上述4种醇提物体外诱导HepG2细胞凋亡的情况,采用小鼠肝癌H22移植瘤模型进行体内抑瘤实验,探讨圆齿野鸦椿各部位醇提物的抗肝癌效果.结果:圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子的乙醇提取物处理细胞48 h后,发现果皮醇提物对HepG2、SMMC-7721和BEL-7404肝癌细胞的抑制效果最好,其半数抑制浓度IC50可分别达到108.34、106.94、114.79 μg·mL-1.采用质量浓度为200 μg·mL-1的圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子醇提物,处理HepG2细胞48 h,均可诱导HepG2细胞凋亡,其中以果皮醇提物的效果最好.体内实验以圆齿野鸦椿果皮、枝条、叶片和种子醇提物200 mg·kg-1对 H22移植瘤小鼠灌胃给药14 d,其抑瘤率可分别达到47.8%、44.9%、42.5%和40.6%.结论:圆齿野鸦椿的乙醇提取物具有良好的抗肝癌作用.

目的 研究索拉非尼对不同人肝癌细胞株HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721 、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6中B7-H3和B7-H4蛋白表达的影响.方法 免疫印迹法和溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)比色法检测索拉非尼在不同人肝癌细胞株中对B7-H3和B7-H4蛋白表达的影响及索拉非尼对不同人肝癌细胞株的抑制作用.结果 不同人肝癌细胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表达较正常人肝细胞(HL-7702)均显著上调(P＜0.01).索拉非尼对Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3和HCCLM6肝癌细胞株的细胞毒活性IC50值分别为14.56、9.14、946、17.21、9.29 μmol/L.分别以5、10、20 μmol/L剂量索拉非尼处理Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6后,B7-H3和B7-H4蛋白表达均较对照组显著下调(P＜0.01).结论 B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌细胞株中通常过表达,可影响肿瘤免疫逃逸,可能是未来肝癌防治的一个新靶点.

目的 探讨Hedgehog信号通路关键蛋白Gli1对人肝癌细胞中Twist1蛋白表达和细胞迁移的影响.方法 应用蛋白免疫印迹技术在Huh7、HepG2、PLC、SMMC-7721、Bel-7404五种人肝癌细胞中筛选Gli1高表达细胞系,根据GenBank数据库设计并合成3条Gli1-siRNA经质粒转染到已筛选出Gli1高表达的人肝癌细胞中,分别为pGCsi-U6-GLi1 siRNA-1(siRNA-1组)、pGCsi-U6-GLi1 siRNA-2(siRNA-2组)、pGCsi-U6-GLi1 siRNA-3(siRNA-3组),而空白对照组(N组)不转染任何序列,阴性对照组转染阴性对照序列(NC组).转染48h后分别使用实时荧光定量PCR和Western blotting法检测各组Gli1mRNA和蛋白表达,筛选出最佳siRNA序列.对筛选出的最佳siRNA序列组的细胞,采用细胞划痕实验观察其迁移能力,用Western blotting检测该组细胞中Twist1、E-Cadherin蛋白表达.结果 Western blotting检测结果提示,与另外4种人肝癌细胞比较,Bel-7404细胞株中Gli1表达量增加(P均＜0.05);与其他组比较,siRNA-2组中的Gli1表达量最低(P均＜0.05);与N组比较,siRNA-2组中的Twist1蛋白表达下调,E-cadherin表达上调,N-Cadherin和Vimentin表达下调,迁移能力下降(P均＜0.05).结论 Gli1可上调肝癌Bel-7404细胞中Twist1蛋白表达,促进入上皮-间质细胞转化及迁移.