目的:通过观察高浓度丁酸钠(sodium butyrate，NaB)(5 mmol/L，8 mmol/L)对单层Caco-2细胞肠屏障模型的作用，及该过程中对NF-κB通路的影响，旨在探讨高浓度NaB破坏单层Caco-2细胞肠屏障模型的可能分子机制。方法:使用不同浓度的NaB及雷公藤甲素(triptolide，TP)(特异性抑制NF-κB)50 nmol/L作用体外培养的Caco-2细胞及单层Caco-2细胞肠屏障模型，按照作用的试剂和浓度分为0 mmol/L NaB(对照组)、50 nmol/L TP组(TP组)、2 mmol/L NaB组(NaB Ⅰ组)、5 mmol/L NaB(NaB Ⅱ组)、8 mmol/L NaB(NaB Ⅲ组)、5 mmol/L NaB＋50 nmol/L TP组(NaB＋TP组)。测定单层Caco-2细胞肠屏障模型的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TER)及菊粉-FITC(inulin-FITC)的通透性；用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白水平；用核质分离试验检测p65蛋白入核水平的变化。结果:①高浓度NaB(5 mmol/L、8 mmol/L)作用于单层Caco-2细胞肠模型72 h后，与对照组相比，TER显著下降，inulin-FITC通透性显著升高；如5 mmol/L NaB作用于单层Caco-2细胞肠屏障72 h，TER降低至(106.33±4.04)(Ω×cm 2)，inulin-FITC的通透性升高至(12.52±1.82)%，与对照组相比，差异均具有统计学意义( P<0.05)；而使用50 nmol/L TP特异性抑制NF-κB后，其TER升高至(398.33±3.06)(Ω×cm 2)，inulin-FITC的通透性降低至(7.24±0.25)%，差异具有统计学意义( P<0.05)，提示5 mmol/L NaB对肠屏障的破坏作用被显著抑制；②高浓度NaB(5 mmol/L、8 mmol/L)作用Caco-2细胞72 h，IL-1β和TNF-α mRNA及蛋白的表达水平较对照组显著提高，且p65蛋白入核水平也显著提高，差异具有统计学意义( P<0.05)；③在5 mmol/L NaB的基础上，使用TP抑制NF-κB后，可显著抑制高浓度NaB诱导IκB-α的磷酸化及p65蛋白入核，并显著降低IL-1β与TNF-α的表达水平。 结论:高浓度NaB可破坏肠屏障功能，其机制可能与活化NF-κB通路，促进炎症因子释放相关。

严重烫伤后肠道缺血缺氧会引起肠上皮屏障受损，发生肠道细菌移位（EBT），从而导致严重的并发症，如SIRS、脓毒症和MOF的发生。囊性纤维化穿膜传导调节蛋白（CFTR）可因肠上皮细胞缺氧而表达下调，进而影响紧密连接蛋白的正常结构与功能，而紧密连接蛋白正是维持肠道屏障的关键结构。陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院全军烧伤研究所陈婧老师团队联合上海交通大学第九人民医院整复外科章一新教授团队近期在《Burns & Trauma》发文《Molecular mechanism mediating enteric bacterial translocation after severe burn: the role of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator》，使用人Caco-2细胞系建立体外缺氧损伤模型，并建立C57小鼠严重烫伤模型，研究严重烫伤对小鼠肠黏膜屏障、CFTR和紧密连接蛋白表达的影响，同时选取DF 508小鼠（F508del CFTR基因突变小鼠）为体内模型，进一步证明CFTR在维持小鼠正常肠道屏障功能中的作用。研究结果显示，在缺氧条件下，人Caco-2细胞中CFTR的表达显著降低；胞外信号调节激酶（ERK）和核因子κB信号被激活；炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8）分泌增加；带状闭合蛋白1（ZO-1）、闭合蛋白和E-钙黏合素的表达下调；跨上皮电阻值降低；并导致ZO-1在细胞膜上分布不连续，排列不规则。同样地，敲除CFTR导致了相似的改变，且敲除CFTR引起的炎症因子的上调和紧密连接蛋白（ZO-1和闭合蛋白）的下调，可以通过抑制特定的ERK或核因子κB而逆转。与此同时，在严重烫伤小鼠的肠道中观察到大量的促炎症介质分泌和EBT，进一步支持了体外实验结果。与野生型小鼠相比，DF 508小鼠回肠中的TNF-α、IL-1β和IL-8浓度升高。此外，维生素D3被证明可以保护肠道上皮屏障免受缺氧损伤，机制可能与其上调CFTR表达，从而抑制ERK通路激活，减少促炎性细胞因子释放有关。此项研究结果表明，严重烫伤后，肠上皮细胞通过CFTR/ERK/促炎性细胞因子途径调节细胞间紧密连接蛋白的表达，进而调节肠道菌群移位，维生素D3可对严重烫伤后的肠黏膜屏障起到保护作用。

目的:探讨人乳提取物双唾液酸乳糖-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）对坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）肠道屏障的保护作用机制。方法:（1）取2013年2月至2020年12月南通大学附属常州儿童医院病理科保存的新生儿回肠病理组织石蜡块（NEC 12例，肠闭锁9例）切片后行免疫组化染色，比较其肠道紧密连接蛋白——闭锁小带蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）表达情况。（2）取1日龄SD大鼠28只随机分为对照组（8只）、NEC组（10只）和DSLNT+NEC组（10只），NEC组和DSLNT+NEC组以3次/d的频率、连续3 d进行缺氧（95%N 2，10 min）/冷刺激（4 ℃，10 min）诱导新生大鼠NEC模型，DSLNT+NEC组在造模同时于配方奶中添加DSLNT（300 μmol/L）。72 h后处死所有大鼠，取末端回肠组织处理，比较不同组肠组织损伤及ZO-1表达情况。（3）用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建人肠上皮细胞株Caco-2炎性细胞模型并给予DSLNT，分为对照组、LPS组、DSLNT+LPS组，以噻唑蓝法检测细胞活力并以免疫荧光法检测ZO-1表达，验证DSLNT对Caco-2细胞生长和紧密连接的影响。 结果:（1）患儿结果：NEC组病变肠段黏膜层绒毛完整度缺失，肠上皮细胞连接处ZO-1表达明显少于肠闭锁组和NEC组非病变肠段。（2）动物实验结果：NEC组大鼠肠组织病变部位肠上皮层松脱甚至坏死和脱失，ZO-1表达低于对照组和DSLNT+NEC组（ P<0.05）。DSLNT+NEC组大鼠存活率高于NEC组（8/10比6/10），回肠炎症损伤病理评分低于NEC组［2.0（1.0，2.8）比3.5（3.0，4.0）］（ P<0.05）。（3）细胞实验结果：LPS组肠上皮Caco-2细胞出现细胞生长限制和ZO-1免疫荧光暗淡；DSLNT+LPS组Caco-2细胞生长优于LPS组，与对照组相当，同时ZO-1表达强度显著增加。 结论:肠上皮紧密连接损伤是NEC的重要特征之一，ZO-1是NEC药学防治的潜在靶标分子；人乳寡糖单体DSLNT通过调节肠上皮ZO-1表达和紧密连接完整性发挥对新生肠道的保护作用，是天然的肠道屏障调节物质。

目的:探讨Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)在肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的肠黏膜屏障损伤中的保护作用及潜在的分子机制。方法:培养人克隆结肠癌Caco-2细胞14 d体外建立肠黏膜屏障模型，随后转染YAP质粒和对照质粒，24 h后加入TNF-α刺激损伤肠黏膜屏障，48 h后通过细胞计数试剂盒(cell counting kit WST-8，CCK-8)检测肠上皮细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期，迁移小室(Transwell)检测细胞迁移能力。结果:与正常对照组相比，加入TNF-α刺激后，肠上皮细胞增殖活性明显下降，细胞周期G0/G1期比例增加，S期和G2/M期比例减少，而YAP过表达可抑制TNF-α引起的细胞增殖活性下降，使细胞周期顺利从G0/G1期向S期和G2/M期过渡。Transwell结果表明，正常对照组细胞迁移数目为(172.4±13.1)个细胞，加入TNF-α刺激后，细胞的迁移数目降至(80.4±9.3)个细胞，而预先转染YAP可抑制TNF-α引起的细胞迁移能力下降，细胞迁移数目为(124.2±9.2)个细胞，差异有统计学意义( P<0.01)。 结论:YAP通过促进肠上皮细胞增殖和迁移从而抑制TNF-α诱导的肠黏膜屏障损伤。

目的:旨在探讨人前梯度蛋白2(anterior gradient-2，AGR2)在肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)诱导的肠黏膜屏障损伤中的作用及其机制。方法:通过体外培养人结肠腺癌细胞株Caco-2细胞建立肠黏膜屏障模型，预先转染AGR2质粒和对照质粒，24 h后实验组加入TNF-α刺激细胞，通过实时定量PCR及Western blot检测AGR2表达，通过跨膜电阻检测细胞膜通透性，透射电镜下观察线粒体自噬的发生。结果:Caco-2细胞培养21 d，跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)大于600 Ω·cm 2，趋于稳定，证实体外肠黏膜屏障模型成功构建。在TNF-α诱导的肠上皮屏障损伤模型中，AGR2 mRNA及蛋白表达明显下调，TEER下降至200 Ω·cm 2左右，透射电镜下显示线粒体形态破坏。而预先转染AGR2质粒可抑制TNF-α引起的跨膜电阻值下降，TEER维持在400 Ω·cm 2左右，透射电镜下可见线粒体自噬小体产生。 结论:体外实验证实AGR2基因可抑制TNF-α诱导的肠黏膜屏障损伤，保护线粒体功能，这种保护作用可能是通过诱导线粒体自噬发生实现的。

目的:探讨白藜芦醇（RSV）能否通过激活沉默信息调节子1（SIRT1）调控NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体活化，进而改善脓毒症肠道炎症反应及细胞凋亡，从而发挥肠道屏障功能保护作用。方法:①体外实验：培养人结直肠腺癌细胞（Caco-2），并分为正常组（完全培养基培养48 h），脂多糖（LPS）组（完全培养基培养24 h后加入2 mg/L的LPS处理12 h），RSV低、中、高浓度组及SIRT1抑制剂（EX-527）组（完全培养基培养24 h后加入2 mg/L的LPS处理6 h，随后再分别加入RSV 10、20、40 μmol/L或EX-527 10 μmol/L处理6 h）。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-6、IL-18、IL-1β）等炎性因子水平；用流式细胞仪检测细胞凋亡水平；用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测NLRP3、SIRT1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）及凋亡相关点样蛋白（ASC）的蛋白表达。②体内实验：将24只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组、盲肠结扎穿孔术（CLP）6 h组、CLP 24 h组及RSV干预组（CLP术后6 h、12 h腹腔注射RSV 20 mg/kg），每组6只。采用免疫组化法检测大鼠肠道中NLRP3、caspase-1及ASC表达情况。结果:①与正常组比较，经LPS处理后细胞上清液中炎性因子水平升高，SIRT1蛋白表达降低，NLRP3、caspase-1及ASC蛋白表达升高。与LPS组相比，不同浓度RSV可降低炎性因子水平，增加SIRT1活性，抑制NLRP3炎症小体下游产物caspase-1、ASC的表达，其中40 μmol/L高浓度RSV作用最为明显〔TNF-α（ng/L）：8.77±0.43比12.66±0.81，IL-6（ng/L）：1.35±0.20比1.93±0.09，IL-1β（ng/L）：1.05±0.04比1.31±0.07，IL-18（ng/L）：519.50±11.16比622.70±30.69，SIRT1/β-actin：0.80±0.05比0.58±0.02，caspase-1/β-actin：0.55±0.06比0.78±0.06，ASC/β-actin：0.78±0.08比1.04±0.15，均 P<0.05〕，而SIRT1抑制剂EX-527的作用则相反。正常组、LPS组及RSV低、中、高浓度组和EX-527组间细胞凋亡率差异并无统计学意义〔（7.03±0.57）%、（9.67±0.55）%、（9.57±0.70）%、（9.30±2.15）%、（9.87±0.97）%、（9.07±0.93）%， F＝2.590， P＝0.082〕。②免疫组化结果显示，相比Sham组，CLP 6 h组、CLP 24 h组及RSV干预组大鼠肠道上皮细胞中NLRP3炎症小体及下游产物caspase-1、ASC表达增加。而RSV干预组肠道上皮中ASC表达的阳性面积所占百分比较CLP 6 h组显著减少〔（15.22±2.73）%比（19.88±2.67）%， P<0.05〕，NLRP3及caspase-1表达的阳性面积所占百分比较CLP 24 h组显著减少〔（9.31±1.37）%比（13.19±1.92）%，（19.57±3.92）%比（27.28±6.33）%，均 P<0.05〕。 结论:在体内及体外脓毒症肠道损伤模型中，高浓度RSV可通过激活SIRT1抑制NLRP3炎症小体活化，进而降低下游caspase-1及ASC的表达，发挥抑制炎性因子分泌减轻炎症反应的作用。

目的:探讨肠道缺失胆道胆汁后肠碱性磷酸酶(IAP)在肠黏膜中的表达变化及胆汁对肠上皮Caco-2细胞模型中IAP表达的影响。方法:将30只健康雄性SD大鼠按随机数表法分为3组：对照组( n＝10)，假手术组；梗阻性黄疸组( n＝10)，结扎造成胆道梗阻；胆汁外引流组( n＝10)，造成肠道内胆道胆汁完全丢失。于术后第7天留取回肠标本。应用蛋白质印迹法和免疫组化染色测定大鼠肠黏膜IAP相对表达量。考察不同浓度及不同作用时间下，人胆汁作用于Caco-2细胞后IAP表达量的差异。 结果:3组大鼠模型均成功建立。对照组大鼠肠黏膜中IAP相对表达量为(15.09±0.61)%，显著高于梗阻性黄疸组的(6.86±1.07)%与胆汁外引流组的(9.19±1.67)%，差异均具有统计学意义( P<0.05)。体外细胞实验表明，胆汁能够促进Caco-2细胞中IAP的表达，并且存在时间和剂量依赖性。 结论:肠道内完全缺失胆汁会引起肠黏膜中IAP表达降低。胆汁可以促进IAP在肠黏膜上皮细胞中的表达。

目的:探讨肠炎沙门菌 spvD基因对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞侵袭力及胞内增殖力的影响。 方法:利用自杀质粒介导的同源重组技术构建 spvD基因缺失株，PCR扩增并克隆 spvD基因于pBAD33表达载体获得回补质粒，导入相应缺失株得到回补株，并将pBAD33导入野生株及缺失株作为空载对照。荧光定量反转录聚合酶链式反应检测 spvD mRNA表达水平。以Caco-2细胞作为体外模拟人肠上皮细胞模型，分别将野生株、缺失株及回补株与其共培养，探究 spvD基因对Caco-2细胞的毒力。使用LSD- t检验进行3组间 spvD mRNA表达水平比较及胞内活菌数比较，使用χ2检验进行3组间侵袭率的比较。 结果:以野生株 spvD mRNA表达量作为单位“1”，缺失株为“0.00”、回补株为“2.60”（LSD- t野生株，缺失株=1.11， P=0.31；LSD- t野生株，回补株=-1.77， P=0.13；LSD- t缺失株，回补株=-2.88， P=0.03），该结果证实了缺失株及回补株的成功构建。上述3组肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭实验结果显示，野生株侵袭率为0.23%，缺失株侵袭率为0.16%，回补株侵袭率为0.16%，差异无统计学意义（χ 2=1.13， P=0.570）。通过比较细菌干预Caco-2细胞后不同时间点胞内活菌数，发现在干预16 h时，野生株（6.50×10 6 CFU/ml）、回补株（7.25×10 6 CFU/ml）胞内活菌数明显增多，均高于缺失株（1.90×10 6 CFU/ml）（LSD- t野生株，缺失株=7.95， P=0.00；LSD- t野生株，回补株=-1.27， P=0.25；LSD- t缺失株，回补株=-9.22， P=0.00）。 结论:尚不能认为 spvD基因影响肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭力，但该基因可促进肠炎沙门菌在Caco-2细胞内增殖。

目的:探讨Yes相关蛋白(YAP)在肠上皮屏障损伤中的作用及分子机制。方法:培养人结肠腺癌细胞株Caco-2细胞建立肠上皮屏障模型，分为4组：对照组，正常建好屏障的Caco-2细胞不做任何处理；重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)-α组，建好屏障的Caco-2细胞加入rhTNF-α 100 μg/L刺激细胞；Vector+rhTNF-α组，建好屏障的Caco-2细胞先加入对照质粒pcDNA3.1-vector，24 h后加入rhTNF-α 100 μg/L刺激细胞；YAP+rhTNF-α组，建好屏障的Caco-2细胞先加入YAP质粒pcDNA3.1-YAP，24 h后加入rhTNF-α 100 μg/L刺激细胞。通过实时定量PCR和Western blot检测YAP mRNA和蛋白表达，应用跨膜电阻(TEER)和荧光黄透过率检测细胞膜通透性，免疫荧光染色观察细胞骨架蛋白F-actin分布情况。结果:与对照组[(607.3±29.3)Ω·cm 2]相比，rhTNF-α组TEER[(265.3±32.7)Ω·cm 2]明显下降，而YAP+rhTNF-α组TEER[(387.0±18.7)Ω·cm 2]较rhTNF-α组明显升高，差异均有统计学意义( P<0.001)。荧光黄透过率结果显示，rhTNF-α组(22.7%±0.5%)较对照组(6.3%±0.9%)明显增加，而YAP+rhTNF-α组(12.2%±0.8%)较rhTNF-α组明显降低，差异均有统计学意义( P<0.001)。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，rhTNF-α组细胞骨架F-actin纤维致密斑减少，部分细胞出现明显横跨细胞的应力纤维结构，而YAP+rhTNF-α组周边肌动蛋白丝带较清晰，胞质内应力纤维减少。 结论:YAP可抑制TNF-α引起的Caco-2细胞TEER下降、荧光黄透过率增加和细胞骨架F-actin重排。YAP通过调控细胞骨架蛋白F-actin表达从而改善TNF-α介导的肠上皮屏障功能损伤。

目的:探讨不同严重程度脓毒症肠道损伤模型中NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体表达及其介导的炎症反应和凋亡。方法:体外培养人结直肠腺癌细胞株（Caco-2），取对数生长期细胞分为空白对照组（用完全培养基正常培养）及脂多糖（LPS）1、2、4 mg/L组（用含1、2、4 mg/L LPS的完全培养基培养）。分别于6、12、24 h收集细胞上清液，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-6、IL-1β、IL-18）水平；采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。收集细胞，采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测NLRP3、沉默信息调节因子1（SIRT1）的mRNA表达；采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测NLRP3、SIRT1、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）以及凋亡相关点样蛋白（ASC）的蛋白表达。结果:ELISA结果显示，在同一干预时间点，与空白对照组相比，LPS各组细胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-18水平均呈剂量依赖性增加，并呈一定时间依赖性，其中24 h时LPS 4 mg/L组升高最为显著〔IL-6（ng/L）：3.55±0.06比0.67±0.09，TNF-α（ng/L）：15.37±0.19比5.04±0.14，IL-1β（ng/L）：2.26±0.10比0.56±0.09，IL-18（ng/L）：433.92±22.55比93.55±21.13，均 P<0.05〕。细胞凋亡检测结果显示，与空白对照组相比，LPS各组细胞凋亡率均有增加趋势，并呈一定剂量依赖性和时间依赖性，以24 h时LPS 4 mg/L组细胞凋亡率升高最为显著〔（14.83±3.73）%比（5.87±1.17）%， P<0.05〕。RT-qPCR结果显示，随LPS剂量增加和干预时间延长，细胞NLRP3 mRNA表达逐渐升高，而SIRT1 mRNA表达则呈下降趋势，24 h时LPS 4 mg/L组与空白对照组比较差异均有统计学意义〔NLRP3 mRNA（2 -ΔΔCt）：8.20±2.82比1.00±0.36，SIRT1 mRNA（2 -ΔΔCt）：0.58±0.01比1.03±0.06，均 P<0.05〕。Western blotting显示，与空白对照组相比，LPS各组NLRP3、caspase-1、ASC的蛋白表达均明显升高，SIRT1蛋白表达明显降低；在各干预时间点，随LPS剂量增加，NLRP3、caspase-1、ASC的蛋白表达逐渐升高，而SIRT1蛋白表达逐渐降低，24 h时LPS 4 mg/L组与空白对照组比较差异均有统计学意义〔NLRP3蛋白（NLRP3/β-actin）：1.48±0.03比0.90±0.12，caspase-1蛋白（caspase-1/β-actin）：1.18±0.11比0.72±0.09，ASC蛋白（ASC/β-actin）：1.09±0.01比0.82±0.03，SIRT1蛋白（SIRT1/β-actin）：0.48±0.03比0.76±0.05，均 P<0.05〕。 结论:在体外脓毒症肠道炎症模型中，随LPS剂量增加及干预时间延长，肠道炎症反应及细胞凋亡呈增加趋势，可能与NLRP3炎症小体及下游分子ASC与caspase-1表达上调、SIRT1表达下调相关。