目的:探讨人乳提取物双唾液酸乳糖-N-四糖（disialyllacto-N-tetraose，DSLNT）对坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）肠道屏障的保护作用机制。方法:（1）取2013年2月至2020年12月南通大学附属常州儿童医院病理科保存的新生儿回肠病理组织石蜡块（NEC 12例，肠闭锁9例）切片后行免疫组化染色，比较其肠道紧密连接蛋白——闭锁小带蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）表达情况。（2）取1日龄SD大鼠28只随机分为对照组（8只）、NEC组（10只）和DSLNT+NEC组（10只），NEC组和DSLNT+NEC组以3次/d的频率、连续3 d进行缺氧（95%N 2，10 min）/冷刺激（4 ℃，10 min）诱导新生大鼠NEC模型，DSLNT+NEC组在造模同时于配方奶中添加DSLNT（300 μmol/L）。72 h后处死所有大鼠，取末端回肠组织处理，比较不同组肠组织损伤及ZO-1表达情况。（3）用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）构建人肠上皮细胞株Caco-2炎性细胞模型并给予DSLNT，分为对照组、LPS组、DSLNT+LPS组，以噻唑蓝法检测细胞活力并以免疫荧光法检测ZO-1表达，验证DSLNT对Caco-2细胞生长和紧密连接的影响。 结果:（1）患儿结果：NEC组病变肠段黏膜层绒毛完整度缺失，肠上皮细胞连接处ZO-1表达明显少于肠闭锁组和NEC组非病变肠段。（2）动物实验结果：NEC组大鼠肠组织病变部位肠上皮层松脱甚至坏死和脱失，ZO-1表达低于对照组和DSLNT+NEC组（ P<0.05）。DSLNT+NEC组大鼠存活率高于NEC组（8/10比6/10），回肠炎症损伤病理评分低于NEC组［2.0（1.0，2.8）比3.5（3.0，4.0）］（ P<0.05）。（3）细胞实验结果：LPS组肠上皮Caco-2细胞出现细胞生长限制和ZO-1免疫荧光暗淡；DSLNT+LPS组Caco-2细胞生长优于LPS组，与对照组相当，同时ZO-1表达强度显著增加。 结论:肠上皮紧密连接损伤是NEC的重要特征之一，ZO-1是NEC药学防治的潜在靶标分子；人乳寡糖单体DSLNT通过调节肠上皮ZO-1表达和紧密连接完整性发挥对新生肠道的保护作用，是天然的肠道屏障调节物质。

目的:探讨双唾液酸乳糖-N-四糖(DSLNT)对坏死性小肠结肠炎(NEC)新生大鼠肠道内容物低分子量代谢谱的影响，探索其对新生儿肠道的保护作用方式。方法:新生SD大鼠按随机数表法随机分为对照组、NEC组和NEC+DSLNT组，大鼠均采用特殊配方奶人工喂养，NEC组和NEC+DSLNT组以3次/d的频率进行缺氧(950 mL/L氮气，10 min)/冷刺激(4 ℃，10 min)、连续3 d诱导新生大鼠NEC模型，NEC+DSLNT组在特殊配方奶中添加300 μmol/L DSLNT。造模72 h时处死所有存活大鼠，采集回结肠部位肠内容物进行基于超高效液相色谱-组合型四级杆Orbitrap质谱仪(UHPLC-QE-MS)的非靶向代谢组检测，末端回肠行苏木精-伊红染色。代谢组数据用SIMCA 14.1软件进行多元变量统计分析。以正交偏最小二乘分析(OPLS-DA)模型的变量投影重要度(VIP)值>1和 t检验中 P<0.05筛选两两比较的组间差异代谢物。 结果:DSLNT降低NEC发生率和NEC大鼠回肠组织病理学评分[3.0(2.0，3.0)分比1.0(1.0，2.0)分， P<0.01]，并可有效抑制炎症浸润。基于UHPLC-QE-MS代谢组检测结果建立的OPLS-DA模型能较好地对NEC组和对照组、NEC+DSLNT组和NEC组实现分离。NEC组和对照组之间有64个差异代谢物(OPLS-DA模型的VIP值>1且 P<0.05)，包括二十二碳六烯酸(+288.0%， P＝0.028)、黄嘌呤(+372.1%， P＝0.007)、L-精氨酸(+233.1%， P＝0.027)、L-亮氨酸(+232.7%， P＝0.015)、N-乙酰神经氨酸(-41.6%， P＝0.014)等，这些代谢物可映射到34条不同的代谢通路，其中精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等6条代谢通路为NEC主要扰动的代谢通路。NEC+DSLNT组与NEC组之间存在15种差异代谢物，包括D-甘露糖(-73.5%， P＝0.032)、黄嘌呤(-63.4%， P＝0.008)、亚油酸(+137.9%， P＝0.047)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(+278.2%， P＝0.005)等，这些差异代谢物可映射到7条代谢通路，其中亚油酸代谢为DSLNT主要影响的差异代谢通路。两种比对策略中重合的差异代谢物数量为8个，其在NEC中的变化趋势在DSLNT给药组中均出现显著逆转。 结论:DSLNT能显著缓解缺氧/冷刺激造成的新生大鼠NEC病理损伤，该保护作用与其改善NEC造成的肠内容物代谢谱偏移、调节亚油酸代谢通路有关。DSLNT的早期预防性补充对维护新生儿肠道稳态、预防NEC病理进程具有重要意义。

2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL)是一种含量最丰富的人乳寡糖,微生物全细胞合成是生产 2'-FL的重要方法.乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为一种可直接用于乳制品的食品级微生物,目前还没有用于生产人乳寡糖的报道.首先,在两种常用L.lactis底盘NZ3900 和NZ9000 中利用含有基因fkp、futC、lacF的重组质粒pNZ8148-2f构建 2'-FL补救合成途径,在添加 10 g/L岩藻糖和 5 g/L乳糖的发酵培养基中,测得 2'-FL的摇瓶产量分别为 0.16 g/L与 0.4 g/L,结合对二者生长状况等综合分析,选取NZ9000 作为优势底盘.然后,在NZ9000 中构建 2'-FL从头合成途径,利用同源重组技术并借助L.lactis中特有的敲除整合载体pNZ5319,在敲除非必需基因upp的同时将基因manA、manB、gmd和wcaG整合到染色体上,借助载体pNZ8148-1 将基因manC、futC和lacF以质粒的形式引入到细胞中,同时利用不同启动子P32、Pnis对酶的表达水平进行组合调控.获得最优菌株NZ9000 6,在添加 20 g/L葡萄糖和 5 g/L乳糖的发酵培养基中,测得 2'-FL的摇瓶产量为 0.28 g/L.最后,在发酵培养基中对氯化高铁血红素、胰蛋白胨和酵母粉的浓度进行了优化,在添加 2.5 μg/mL氯化高铁血红素、15 g/L胰蛋白胨、6 g/L酵母粉时 2'-FL的摇瓶产量达到 1.58 g/L,为相关报道的较高水平.该研究证实了L.lactis合成 2'-FL的可行性,为 2'-FL的生产提供了新思路.

母乳喂养可以为健康婴儿的生长发育提供最佳的营养.近年来的研究显示母乳喂养能预防儿童期肥胖的发生,但某些母乳喂养特别是纯母乳喂养的婴儿为何肥胖,这种现象对远期健康产生怎样的影响等问题逐渐引起学者们的重视.本文对母乳喂养婴儿肥胖的危险因素及预后研究进行总结,母乳中的高蛋白质含量,高水平的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胃饥饿激素、瘦素以及寡糖多样性可能是导致母乳喂养婴儿生长过快的危险因素;人乳奶瓶喂养、夜间喂养次数多、每次喂养持续时间长、每次喂养间隔时间短等喂养行为问题也是母乳喂养婴儿肥胖的高危因素.不论是对母乳喂养还是配方奶喂养的婴儿,婴儿期超重或肥胖都会增加以后儿童期肥胖的风险.

目的 探讨人母乳糖巨肽(GMP)的水平,为优化初生婴儿配方奶粉的营养成分提供参考.方法 选取身体健康、无特殊饮食习惯、生活安定、奶量充足,年龄25 ～ 39岁,第1胎足月经阴道自然分娩的产妇30例.分为初乳组和成熟乳组,每组15例,每例采集5 mL母乳(前段乳汁).初乳组采集的时间为产后第2天,成熟乳组采集的时间为产后第42天.采用凝乳酶对母乳进行水解,再采用唾液酸测试盒检测上清液中唾液酸水平(比色法),并以此代表GMP的相对水平.另外,选取6种市售品牌配方奶粉作为奶粉组,各自配制成液态标准奶,用同样方法检测其唾液酸水平.采用方差分析法比较各组唾液酸水平.结果 GMP最佳酶解条件:酶液质量浓度0.25 g/L,酶解时间120 min.初乳组唾液酸质量浓度为(3486.98±406.70) mg/L,成熟乳组唾液酸质量浓度为(2687.95±375.85) mg/L,2组比较差异具有统计学意义(P＜0.01),前者高于后者,且各组内个体间差异小(CV初乳=0.12,CV成熟乳=0.14).配方奶粉组唾液酸质量浓度为(1196.93 ± 608.40) mg/L,低于初乳和成熟乳中的水平,差异均具有统计学意义(P均＜0.01)；各种品牌配方奶粉的平均唾液酸水平差异较大(CV=0.63).结论 人初乳中GMP的水平较成熟乳高；不同品牌婴幼儿配方奶粉中的GMP水平多寡不均,测得值与人乳比较也存在较大差异.但由于人乳和牛乳GMP分子质量及所含氨基酸残基数量不同,因而达到同样的GMP生理功效所需人乳或牛乳GMP水平可能不同.为优化初生婴儿配方奶粉的营养成分,使之更接近人乳,有必要进一步探讨相对于人乳的最佳配方奶粉GMP水平.

人乳寡糖(Human milk oligosaccharides,HMO)是母乳中重要的免疫活性成分,对婴幼儿健康起到显著促进作用.2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)是HMO的主要组分,极具应用价值,3-岩藻糖基乳糖(3-FL)与2'-FL的合成途径相似,两者的研究具有相互借鉴意义,近年来针对它们的研究取得了较多进展.以微生物细胞工厂为核心理念的新型生物合成途径有望将2'-FL和3-FL产业化,未来将对乳制品行业产生重要的影响.文中综述了生物技术制备2'-FL和3-FL的最新研究进展,并对未来发展趋势进行了展望.

1 背景过去10年来,国内NICU早产儿数量明显增加,随着救治技术进展及救治水平的提高,极早和超早产儿存活率明显提高[1].但是早产儿的严重疾病[脑损伤、严重感染、坏死性小肠结肠炎( NEC)、支气管肺发育不良、早产儿视网膜病变等]使住院时问延长,严重影响患儿的预后,给社会和家庭带来沉重的疾病负担.越来越多的研究[2]表明,母乳喂养在早产儿救治中具有重要作用.母乳不仅含有丰富的营养物质,还含有大量生物活性物质.初乳中含丰富的免疫球蛋白,其中最重要的为分泌型IgA,可为婴儿提供重要的免疫保护作用.母乳中含多种具有抗氧化作用的物质、生长因子、激素及人乳寡糖等重要活性物质,对预防疾病、促进婴儿生长发育和远期健康具有重要作用.此外,母乳中含有大量活细胞,包括免疫细胞及干细胞.同时,临床研究已证实[3,4] ,母乳喂养可降低早产儿严重疾病发生率,促进早产儿早期建立肠内营养,有利于早产儿生长发育和远期健康.

目的:研究氧化苦参碱通过提高乳腺癌细胞中miRNA-122的表达改善其代谢的作用机制.方法:人乳腺癌MCF-7细胞分为空白对照组和氧化苦参碱组,氧化苦参碱组以5、10、20 μmoi/L氧化苦参碱处理细胞.以流式细胞术检测细胞周期的改变,CCK-8法检测细胞增殖能力,克隆形成实验检测肿瘤细胞克隆形成能力,Transwell小室试验检测肿瘤细胞侵袭能力,同时检测细胞的葡萄糖消耗量和乳酸产生水平,Western blot检测糖代谢关键酶PKM、CS、HK蛋白表达.RT-QPCR检测miRNA-122的表达.miRNA-122的反义寡核苷酸抑制其表达,在此基础上用氧化苦参碱干预.检测乳腺癌的活力和代谢酶的变化.结果:氧化苦参碱处理后,细胞中miRNA-122的表达显著升高,G0/G1期比例显著升高,同时细胞活力显著降低,侵袭能力和克隆形成能力也受到显著抑制,细胞中PKM、CS、HK蛋白表达显著降低.葡萄糖的消耗及乳酸产生水平降低显著(P＜0.05).而反义寡核苷酸抑制miRNA-22的表达后,氧化苦参碱对乳腺癌细胞的上述影响显著减弱(P＜0.05).结论:氧化苦参碱可通过提高miRNA-122的表达,下调代谢酶,改善乳腺癌细胞糖代谢的水平,从而发挥抗肿瘤作用.

母乳是新生儿最理想的营养剂.其中,人乳寡糖作为母乳的第三大固体组分,对新生儿的生长、发育及健康状况有重要影响,被应用于婴幼儿配方食品中.2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL),是分泌型母乳中含量最高的人乳寡糖,约占人乳寡糖总量的30％,具有重要的营养和医学价值.2'-FL能够促进婴幼儿生长发育、提高其认知能力、增强免疫力、抗过敏、抗病毒,以及调节肠道菌群,是极具潜力的新型营养强化剂.但是,2'-FL来源于母乳,依靠分离、提取获得大量2'-FL并不现实,因此亟需进行人工合成.人工合成2'-FL的方法有3种,包括:化学合成法、酶催化合成法和全细胞生物合成法.全细胞生物合成法因其成本相对低廉,且易于规模化扩大,而引起了国内外的广泛关注和研究.目前,国外很多跨国公司均开始布局2'-FL的工业化生产和应用,而我国在该领域尚处于研发阶段,因此,了解和掌握2'-FL的合成方法对我国开展2'-FL规模化生产具有重要的意义.本文旨在介绍2'-FL的功能特性,系统阐述其全细胞生物合成的关键技术和最新进展,讨论了针对限速步骤进一步提高产量的策略,旨在为2'-FL的合成和商业化生产提供生物学依据,为今后开发接近母乳的婴幼儿配方奶粉奠定基础.

目的 研究皮下注射以CpG寡脱氧核苷酸为佐剂的人乳头瘤病毒(HPV)多肽疫苗对小鼠原位宫颈癌的抑制作用.方法 采用6～8周C57BL/6小鼠,通过将TC-1细胞直接注入子宫颈附近的阴道黏膜下层来模拟原位宫颈癌的发生,建立小鼠原位宫颈癌模型,分析以CpG ODN作为佐剂的HPV E7多肽疫苗对小鼠肿瘤生长的抑制作用;应用流式细胞术研究以CpG ODN作为佐剂的HPV E7多肽疫苗对C57BL/6小鼠宫颈局部肿瘤微环境的影响;制备负载HPV 16 E7多肽和佐剂CpG ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗,利用透射电镜观察甘露糖修饰的脂质体疫苗形态,利用激光粒度分析仪在水中测量脂质体疫苗的粒度分布和zeta电位,应用荷宫颈癌的小鼠,研究负载HPV 16 E7多肽和佐剂CpG ODN的甘露糖修饰脂质体疫苗对晚期宫颈癌的治疗作用;应用流式细胞术研究脂质体疫苗对小鼠产生特异性细胞免疫应答的影响;应用qRT-PCR研究肿瘤组织中的细胞因子、趋化因子及基质金属蛋白酶(MMP)等表达水平;应用免疫组织化学法研究肿瘤组织中的凋亡、侵袭、血管形成及胶原分布等对小鼠肿瘤微环境的影响.结果 皮下注射CpG ODN为佐剂的HPV多肽治疗性疫苗,可显著增加肿瘤局部浸润的CD4+T细胞和CD8+T细胞,降低肿瘤局部的骨髓衍生抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关成纤维细胞(CAFs),调节一系列与肿瘤增殖、侵袭、转移及血管形成相关的细胞因子、趋化因子、MMPs等分子的表达水平.结论 皮下注射CpG ODN为佐剂的HPV多肽治疗性疫苗可抑制已建立的原位宫颈转移瘤的生长.