分析耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）分子流行病学及探讨 blaKPC和 blaNDM水平传播机制，为预防和治疗CRKP提供参考依据。回顾性分析2022年1—12月湖南中医药大学第一附属医院临床非重复分离的CRKP，共计 49株。采用改良碳青霉烯灭活实验（mCIM）、EDTA-碳青霉烯灭活实验（eCIM）进行表型筛选；聚合酶链式反应（PCR）检测CRKP碳青霉烯耐药基因、β内酰胺酶耐药基因和毒力基因；多位点序列分析检测CRKP菌株的同源性。通过接合试验，推断 blaKPC和 blaNDM两种碳青霉烯耐药基因的水平传播机制。结果显示，本研究共收集到CRKP 49株，有44株携带 blaKPC，8株携带 blaNDM，其中同时携带 blaKPC和 blaNDM两种耐药基因的CRKP（ blaKPC+ blaNDM-CRKP）有3株。28株CRKP携带毒力基因（28/49，57.2%），1株CRKP拉丝试验阳性，且同时携带 Aerobactin和 rmpA两种毒力基因。共检出5种ST型，以ST11为主（41/49，83.7%）。3株 blaKPC-CRKP均接合成功，3株 blaNDM-CRKP仅1株接合成功，接合子菌株对亚胺培南以及头孢菌素类抗菌药物的敏感性均显著降低。综上，本研究CRKP耐药机制主要以产KPC酶为主，且同时携带多种β-内酰酶耐药基因，并有高毒力耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（high virulence carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，hv-CRKP）和 blaKPC+ blaNDM-CRKP的局部流行。 blaKPC和 blaNDM可通过质粒水平传播，不同菌株的水平传播效率存在差异。

目的:研究浙江省临床分离沙门菌的血清型分布、耐药状况和携带毒力基因的特征。方法:收集2010年至2017年浙江省9个地区临床分离的463株沙门菌，依据沙门菌属Kauffmann-White抗原表对比确定沙门菌属的血清型。采用K-B纸片扩散法进行药物敏感试验。采用聚合酶链反应检测菌株的11种毒力基因。结果:463株沙门菌共检出35种血清型，其中优势血清型为鼠伤寒沙门菌[41.90%(194/463)]和肠炎沙门菌[22.25%(103/463)]。对氨苄西林的耐药率[66.52%(308/463)]最高，其次为氨苄西林/舒巴坦[46.87%(217/463]；对哌拉西林/他唑巴坦的耐药率[3.24%(15/463)]较低；无亚胺培南和美罗培南耐药株；多重耐药菌株188株(40.60%)。毒力基因 hilA、 ssrB、 marT、 siiD、 sopB、 pagN在所有沙门菌株中都存在。毒力基因 vexA只在伤寒沙门菌和都柏林沙门菌中检出；毒力基因 icmF主要存在于肠炎沙门菌中；毒力质粒基因 spvB和 pefA表现为成对出现，且主要分布于猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌中；毒力基因 cdtB则主要分布于伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌中。 结论:浙江省临床分离的沙门菌以鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌为主，多重耐药形势严峻，且携带多种毒力基因。

目的:拯救肠道病毒A组71型(enterovirus group A type 71, EV-A71)VP1蛋白突变型毒株(Val147→Ala)，探究该位点对病毒毒力的影响。方法:以SDLY107构建的质粒pMD19-T-EGFP-107为模板，利用定点突变和反向遗传学技术构建重组质粒pMD19-T-EGFP-107(VP1-1)，重组质粒转染至BSR-T7/5细胞，转染产物在RD细胞中连续传代3次，成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，qRT-PCR检测病毒复制力，细胞增殖(CCK-8)和乳酸脱氢酶(LDH)实验检测病毒致细胞损伤力。结果:重叠融合PCR扩增得到目的片段，大小约3.4 kb；重组质粒经双酶切鉴定，测序验证突变成功。重组质粒转染BSR-T7/5细胞24 h观察到明显荧光，所收培养物上清接种至RD细胞24 h观察到明显荧光。qRT-PCR检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞中的复制能力弱于强毒株SDLY107( t＝9.58， P<0.001)。CCK-8、LDH实验检测到突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)在RD细胞( t＝106.60， P<0.001； t＝39.88， P<0.001)、SH-SY5Y细胞( t＝18.72， P<0.001； t＝19.09， P<0.001)中的致细胞损伤力均明显弱于强毒株SDLY107。 结论:成功拯救突变型毒株SDLY-EGFP-107(VP1-1)，证实VP1蛋白第147位氨基酸位点突变可降低病毒的复制力及其致细胞损伤力，为进一步研究VP1蛋白在EV-A71致病机制中的作用提供基础。

目的:筛查住院患者肠道定植耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(carbapenem-resistant Enterobacterales，CRE)的检出率，并分析CRE菌株分子的流行病学特征。方法:本研究为前瞻性研究。采集2019年3月至12月安徽医科大学第二附属医院外科重症监护病房、内科重症监护病房和血液内科(移植病房)213例住院患者的粪便、直肠拭子或肛周拭子标本，应用含碳青霉烯类药物的麦康凯平板法筛查CRE菌株，并进行细菌鉴定、药物敏感试验，选取重点菌株进行全基因组测序，并分析其多位点序列分型、荚膜血清型、耐药基因、毒力基因和质粒携带特征。以菌株KPN FJ723042序列作为参考，对所有菌株序列进行单核苷酸多态性分析。结果:共检出CRE菌株23株，检出率为10.8%(23/213)；其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)15株(65.2%)，大肠埃希菌和阴沟肠杆菌各3株(13.0%)，弗氏柠檬酸杆菌2株(8.7%)。单核苷酸多态性聚类分析表明，15株CRKP有2组主要克隆型，均在外科重症监护病房内流行。15株CRKP均属于ST11-K64型，均携带β-内酰胺类耐药基因肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶2型(β-lactamase Klebsiella pneumoniae carbapenemase 2， blaKPC-2 )基因；12株CRKP携带毒力基因黏液表型调控基因2型(regulator of mucoid phenotype gene A2, rmpA2)、 iucABCD。 结论:住院患者中肠道定植CRE的检出率较高，以ST11-K64型CRKP为主，CRKP菌株兼具多重耐药性和毒力特征，有医院传播风险。

目的:构造乙脑病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)/寨卡病毒(Zika virus, ZIKV)嵌合株JEV/ZIKV包膜蛋白D393E突变的病毒感染性克隆并进行突变株的拯救，探讨D393E突变对病毒小鼠脑内神经毒力的影响情况。方法:利用分子克隆和重叠延伸PCR技术构造含D393E突变的嵌合病毒质粒，并用线性化处理后的质粒片段进行转录，取得病毒RNA，电转染入细胞，获得突变株。用突变病毒、源病毒分别感染细胞和小鼠，对比两种病毒的复制效率、蚀斑特点以及脑内神经毒力差异。结果:酶切结果证实：突变株JEV/ZIKV (D393E)感染性克隆成功地构建。病毒蚀斑实验：JEV/ZIKV (D393E)的蚀斑直径为0.7±0.2 mm，JEV/ZIKV蚀斑直径为1.3±0.2 mm。病毒小鼠脑内毒力检测：JEV/ZIKV (D393E)的LD 50为31.51PFU，JEV/ZIKV的LD 50为2.21PFU。 结论:ZIKV D393E突变使嵌合病毒对小鼠的脑内神经毒力减弱。

目的:探讨肠炎沙门菌 spvD基因对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞侵袭力及胞内增殖力的影响。 方法:利用自杀质粒介导的同源重组技术构建 spvD基因缺失株，PCR扩增并克隆 spvD基因于pBAD33表达载体获得回补质粒，导入相应缺失株得到回补株，并将pBAD33导入野生株及缺失株作为空载对照。荧光定量反转录聚合酶链式反应检测 spvD mRNA表达水平。以Caco-2细胞作为体外模拟人肠上皮细胞模型，分别将野生株、缺失株及回补株与其共培养，探究 spvD基因对Caco-2细胞的毒力。使用LSD- t检验进行3组间 spvD mRNA表达水平比较及胞内活菌数比较，使用χ2检验进行3组间侵袭率的比较。 结果:以野生株 spvD mRNA表达量作为单位“1”，缺失株为“0.00”、回补株为“2.60”（LSD- t野生株，缺失株=1.11， P=0.31；LSD- t野生株，回补株=-1.77， P=0.13；LSD- t缺失株，回补株=-2.88， P=0.03），该结果证实了缺失株及回补株的成功构建。上述3组肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭实验结果显示，野生株侵袭率为0.23%，缺失株侵袭率为0.16%，回补株侵袭率为0.16%，差异无统计学意义（χ 2=1.13， P=0.570）。通过比较细菌干预Caco-2细胞后不同时间点胞内活菌数，发现在干预16 h时，野生株（6.50×10 6 CFU/ml）、回补株（7.25×10 6 CFU/ml）胞内活菌数明显增多，均高于缺失株（1.90×10 6 CFU/ml）（LSD- t野生株，缺失株=7.95， P=0.00；LSD- t野生株，回补株=-1.27， P=0.25；LSD- t缺失株，回补株=-9.22， P=0.00）。 结论:尚不能认为 spvD基因影响肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭力，但该基因可促进肠炎沙门菌在Caco-2细胞内增殖。

目的:分析1株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的耐药及毒力特征。方法:将浙江大学医学院附属第二医院粪便中分离到的1株CRKP命名为肺炎克雷伯菌C35，采用微量肉汤稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度；全基因组测序和基因组分析确定菌株所携带耐药基因和毒力基因；核心基因组单核苷酸多态性（SNP）分型分析CRKP菌株之间的同源性关系；采用接合试验评估耐药基因的转移能力和效率；采用大蜡螟毒力实验测定菌株的毒力表型。结果:肺炎克雷伯菌C35对大多数受试药物耐药，尤其碳青霉烯类、舒巴坦和多黏菌素。SNP分型显示肺炎克雷伯菌C35与多株分离自本院不同病房的CRKP菌株具有很高的同源性。该菌属于ST11型，携带包括 blaKPC-2、 blaCTX-M-199、 mcr-1和 tet（A）变异体等在内的13种耐药基因。 blaKPC-2基因位于>69 800 bp的IncFⅡ型质粒上， blaCTX-M-199和 mcr-1基因共同位于>64 800 bp的IncI2型质粒上， tet（A）变异体位于83 628 bp的不可分型质粒上，3种质粒均为可接合性质粒。肺炎克雷伯菌C35还携带 rmpA和 rmpA2毒力基因以及气杆菌素（aerobactin）相关基因 iucABCD，为典型的碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌（CR-hvKP）。该菌在大蜡螟感染模型中也显示了较强的毒力表型，感染肺炎克雷伯菌C35菌株48 h后大蜡螟幼虫存活率仅为16.7%，明显低于无毒力对照菌株的80.0%。 结论:本研究在1株肠道定植CR-hvKP中检测到多个可接合性耐药质粒，包括同时携带 blaCTX-M-199和 mcr-1基因的IncI2质粒，需引起警惕，并对此类菌株进行主动监测。

目的:研究变异链球菌（Sm）反义vicK RNA（ASvicK）对3种常见口腔链球菌［Sm、血链球菌（Ss）和戈登链球菌（Sg）］构建的多菌种生物膜致龋性的调控作用。方法:通过重组质粒构建ASvicK过表达株，以Sm标准菌株UA159和ASvicK过表达株分别与Ss及Sg构建的多菌种生物膜（分别为UA159+Ss+Sg组、ASvicK+Ss+Sg组）为研究对象，扫描电镜观察生物膜结构；结晶紫染色法检测细菌生物膜总量的差异；通过乳酸试剂盒及蒽酮法评估生物膜产酸产糖能力；利用TaqMan荧光定量PCR及实时荧光定量PCR检测生物膜中3种菌的比例及Sm致龋相关基因的改变；进一步构建人牙釉质片生物膜脱矿模型，用显微硬度仪检测牙釉质表面硬度变化。结果:ASvicK过表达后，Sm+Ss+Sg多菌种生物膜结构疏松。相较于UA159+Ss+Sg组，ASvicK+Ss+Sg组生物膜总量、乳酸产量分别显著降低78.93%及62.23%（均 P<0.001），而生物膜水不溶性和不溶性胞外多糖产量分别显著降低39.13%及68.00%（均 P<0.001）。与UA159+Ss+Sg组相比，ASvicK+Ss+Sg多菌种生物膜中致龋菌Sm比例显著降低33.00%（ P<0.01），Sm致龋相关基因vicK/X、gtfB、gtfC、gtfD和ftf表达显著下调（ P<0.05），牙釉质片脱矿后显微硬度值显著上升至183.84%（ P<0.001）。 结论:ASvicK过表达可降低口腔链球菌生物膜中致龋菌Sm的比例，并减弱口腔链球菌生物膜致龋毒力及致龋性，可能减缓龋病的进展。

鲍曼不动杆菌( Acinetobacter baumannii, Aba)和肺炎克雷伯菌( Klebsiella pneumoniae, Kpn)等条件致病性革兰氏阴性菌导致的院内感染，给医疗卫生管理和人类生命健康带来极大挑战。多重耐药菌株的播散及细菌毒力的增加亟需新的治疗策略应对。Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)是多种革兰氏阴性菌编码的一种保守"分泌装置"，能够以接触依赖的方式将效应蛋白注射到其他原核或真核细胞中，实现抗菌和抗宿主功能，与细菌的环境适应性、竞争力及宿主内定植能力密切相关。T6SS基因簇由核心基因、效应基因以及相关基因组成，其编码的T6SS效应蛋白存在高度多样性，在病原菌感染过程中发挥着重要作用。本文旨在对鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌T6SS介导的细菌间竞争、宿主内定植、接合质粒相互作用以及T6SS表达调控等方面的研究进展进行综述，为未来研究T6SS相关抗菌活性、毒力和耐药等提供理论基础。

目的:从基因组水平上探讨尿路致病性大肠埃希菌UPEC132株的耐药性和致病机制。方法:采用MIC法测定菌株UPEC132对16种抗菌药物的敏感性，多位点序列分型(MLST)方法对其分型，利用三代测序平台对其进行全基因组测序和组装，并用Prodigal软件预测和数据库筛选进行耐药和毒力基因功能注释，然后收集GenBank上23株UPEC菌株的染色体基因组序列，利用RAxML软件对UPEC132进行系统进化分析并构建系统进化树。结果:UPEC132菌株对氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、四环素、红霉素、氯霉素、头孢唑林耐药，其MLST分型为ST10522型。该株全基因组包括一条完整的基因组(染色体)序列及两条质粒序列，染色体、质粒P1和P2的序列大小分别为5 234 468 bp、117 139 bp和101 356 bp，鸟嘌呤-胞嘧啶(GC)含量分别为50.48%、49.05%和54.04%。该株染色体、质粒P1和P2分别有4 856、140和116个基因。其耐药基因多位于染色体，主要为耐多药外排泵基因簇，P2仅携带β-内酰胺酶基因 blaTEM-1和四环素耐药基因 tetG。UPEC132毒力基因也位于染色体，主要为菌毛黏附素9种、铁摄取系统5种和分泌性毒素3种。Afa菌毛和Ⅳ型菌毛基因簇分别位于质粒P1和P2上。系统进化树分析显示UPEC132与23株UPEC均不在同一分支。 结论:UPEC132株的ST10522型为国内外首次报道的大肠埃希菌新ST型，其全基因组遗传信息被全面揭示，耐药性和致病性与其携带的多种耐药基因和毒力基因相关。