目的:研究哮喘中线粒体自噬相关基因(mitochondrial autophagy-related gene,MRG)表达情况、构建疾病预测模型,根据MRG特征对哮喘进行分型并挖掘可能的潜在靶标与治疗药物.方法:基因表达综合数据库中获得哮喘气道上皮转录组学数据,筛选出差异表达MRG,并在哮喘小鼠气道上皮及白介素(interleukin,IL)-13刺激的小鼠原代气道上皮细胞模型中行免疫组化验证;运用机器学习算法构建哮喘预测模型,根据MRG表达谱分型,基因本体论及京都基因与基因组百科全书分析生物学功能及相关信号通路差异;药物基因组学数据库筛选可能的靶向药物.结果:哮喘患者MRG整体表达较健康受试者显著升高,差异最显著基因为线粒体外膜转位酶5(translocase of outer mitochondrial membrane 5,TOMM5),其在哮喘患者、哮喘小鼠气道上皮细胞及IL-13刺激的小鼠原代上皮细胞模型中表达均上调;22个MRG中筛选出7个疾病最相关特征基因(TOMM5、FUN 14结构域蛋白1、线粒体外膜转位酶22、自噬接头受体蛋白1、磷酸甘油酸变位酶5、线粒体融合蛋白2及核糖体蛋白S27a),并以此构建哮喘预测模型,受试者工作特征曲线评估显示预测性能良好;共识聚类分析将哮喘分为2个亚型,两型在基因表达及通路富集方面均存在显著差异;不同分型靶向小分子药物的预测结果分别为XMD8-92和Verrucarin-A.结论:上述7个MRG可作为哮喘预测的有效分子标志物,研究结果有望为患者疾病分型及个体化治疗提供新的参考依据.

该研究探讨了延胡索乙素(tetrahydropalmatine,THP)通过 UNC-51 样激酶 1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)/FUN 14结构域蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)通路抑制线粒体自噬减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygen-ation,H/R)损伤的具体机制.该研究以H9c2心肌细胞为研究对象,构建心肌细胞H/R损伤模型.首先采用细胞活力检测试剂盒检测细胞活性、微量法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出量评估THP对H9c2心肌细胞H/R损伤的保护作用.然后采用化学荧光法检测细胞内活性氧、线粒体内活性氧、线粒体膜电位、自噬小体情况,并用萤光素法检测细胞内三磷酸腺苷(adenosine5'-triphosphate,ATP)含量评估THP对线粒体的保护作用.进一步用免疫印记检测微管相关蛋白 1 轻链 3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)膜型(LC3-Ⅱ)和包浆型(LC3-Ⅰ)的比值,活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)表达水平、ULK1表达水平及其在Ser555位点的磷酸化程度,FUNDC1表达水平及其在Ser17位点的磷酸化程度探索其具体机制.结果显示,THP有效减轻H9c2细胞H/R后线粒体损伤,THP通过降低细胞内和线粒体内活性氧水平、升高线粒体膜电位保护线粒体,进而增加细胞ATP生成、升高细胞活性、降低细胞LDH漏出,减轻H9c2细胞H/R损伤;进一步研究发现THP能够降低自噬小体生成,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,降低凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达,表明THP通过抑制自噬减轻细胞凋亡;深入研究发现THP通过降低ULK1在Ser555位点和FUNDC1在Ser17位点的磷酸化程度,抑制线粒体自噬ULK1/FUNDC1通路激活,抑制线粒体自噬发生.ULK1激动剂BL-918的应用逆向验证了 THP降低ULK1和FUNDC1磷酸化的作用.综上所述,THP通过ULK1/FUNDC1通路抑制线粒体自噬减轻H9c2心肌细胞H/R损伤.

细胞通过自噬方式选择性清除多余或损伤的线粒体,是细胞内线粒体质量控制的重要机制.近期研究表明,酵母细胞主要通过自噬相关基因(Atgs)调控线粒体自噬,而哺乳动物细胞内则由PTEN诱导激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)、NIX/BNIP3L、BNIP3、FUNDC1(FUN14 domain containing 1)、FKBP8/FKBP38、Bcl-2样蛋白 13(Bcl-2-likeprotein 13,Bc12L13)、含核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列的蛋白家族成员X1(NLRX1)、抗增殖蛋白(PHB2)等线粒体膜相关蛋白和心磷脂(cardiolipin,CL)等脂类作为介导线粒体自噬的关键受体而选择性识别受损的线粒体,并通过与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)或γ-氨基丁酸受体相关蛋白(γ-aminobutyric acid receptor-associated protein,GABARAP)结合将其包裹在自噬体内,最终被溶酶体降解清除.本文对线粒体自噬相关受体蛋白的近期研究进展进行综述.

目的 探讨含FUN14域蛋白1(FUNDC1)在高糖损伤的H9c2心肌细胞中通过调控线粒体分裂影响心肌细胞凋亡的作用机制.方法 体外培养H9c2心肌细胞并建立高糖损伤模型,分别进行细胞转染,使用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激活剂5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(AICAR)后,分为正常对照组(CTRL组)、高糖组(HG组)、HG+shRNA-NC组(转染shRNA-NC的HG组细胞)、HG+shRNA-FUNDC1组(转染shRNA-FUNDC1的HG组细胞)和HG+AICAR组(使用AICAR的HG组细胞).MTT法检测细胞存活率;酶标仪检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量;激光共聚焦显微镜观察线粒体结构;Western blot检测线粒体动力相关蛋白1(DRP1)、分裂蛋白1(FIS1)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、活化的胱天蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、FUNDC1和GAPDH的蛋白表达水平.结果 与CTRL组比较,HG组细胞存活率降低,LDH释放量升高,线粒体DRP1(DRP1-mito)、FIS1、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,胞浆DRP1(DRP1-cyto)和Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05).与HG组比较,HG+shRNA-FUNDC1组细胞存活率升高,LDH释放量明显降低,DRP1-mito、FIS1、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平降低,DRP1-cyto和Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05).HG+shRNA-NC组和HG组比较,各指标差异均无统计学意义(P>0.05).CTRL组线粒体主要呈线状结构,HG组和HG+shRNA-NC组线粒体均主要呈点状结构;与HG组比较,HG+shRNA-FUNDC1组线粒体线状结构增多,点状结构减少.与CTRL组比较,HG组FUNDC1蛋白表达水平升高(P<0.05).与HG组比较,HG+AICAR组FUNDC1蛋白表达水平降低(P<0.05).结论 FUNDC1通过调控线粒体分裂影响高糖引起的H9c2心肌细胞凋亡,AMPK信号通路参与该过程.

目的 FUN14结构域蛋白2(FUN14 domain containing 2,FUNDC2)是一种线粒体外膜蛋白,调控缺氧条件下血小板的寿命.血管紧张素II(angiotensinⅡ,AngII)是血管内皮细胞衰老的重要始动因子.本研究目标在于探讨FUNDC2对于人静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)线粒体自噬的作用和其下游可能的信号通路.方法 带有GFP-LC3B标签的活细胞用Mito-Tracker染色以标记线粒体自噬.AngII刺激细胞诱导细胞衰老,采用β-galactosidase染色显示细胞衰老.采用免疫沉淀和Western blot检测FUNDC2蛋白的拟素化修饰和Akt/foxo3a信号通路的活化情况.结果 FUNDC2表达上调增加HUVECs细胞的线粒体自噬水平,并伴有Akt/foxo3a信号通路的活化.在此过程中FUNDC2发生由神经前体细胞表达的发育下调蛋白8(neuronal precursor cell-expressed developmentally down-regulated protein 8,NEDD8)介导的拟素化修饰,NEDD8的27位赖氨酸位点是其与FUNDC2结合必不可少的.AngII可抑制FUNDC2介导的线粒体自噬,与内皮细胞衰老密切相关.结论 FUNDC2发生拟素化修饰对于内皮细胞线粒体自噬非常关键.AngII可能由于干扰FUNDC2介导的线粒体自噬从而诱导内皮细胞衰老.

目的 探讨丹参酮IIA在防治脓毒血症急性肾损伤(AKI)方面的作用及潜在机制.方法 将30只C57BL/6小鼠随机分为对照组(10 mg/kg LPS等体积无菌生理盐水)、LPS组(10 mg/kg LPS作用24 h)、LPS+丹参酮IIA组(10 mg/kg丹参酮IIA预处理15 min再给予10 mg/kg LPS作用24 h)(10只/组).给药后检测小鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮水平(BUN),PAS染色观察小鼠肾组织病理变化,Western blot检测小鼠肾组织RIP3、Cleaved-caspase3、p18-FUNDC1表达水平.将体外培养正常的人肾小管上皮细胞(HK-2)分为空白对照组、LPS刺激组(LPS,10μg/mL)、LPS+siNC组(LPS 10μg/mL+50 nmol/L siNC)、LPS+siRIP3组(LPS 10μg/mL+50 nmol/L siRIP3)、丹参酮IIA干预组(LPS 10μg/mL+丹参酮IIA 10 mg/L),分别给予以上干预措施.采用TUNEL方法检测各组HK-2细胞的凋亡情况,Western blot检测各组RIP3、Cleaved-caspase3、p18-FUNDC1表达水平,qT-PCR检测RIP3基因表达水平.结果 与对照组相比,LPS作用小鼠24 h后,小鼠Scr及血BUN水平升高,PAS染色提示近段肾小管损伤,肾组织中RIP3、Cleaved-caspase3、p18-FUNDC1蛋白表达上调(P<0.001).与LPS组相比,丹参酮IIA预处理后,小鼠Scr及BUN水平下降,PAS染色显示近段肾小管损伤减轻,肾组织中RIP3、Cleaved-caspase3、p18-FUNDC1蛋白表达下降(P<0.001).体外研究显示,与对照组相比,LPS刺激的HK-2细胞后,TUNEL染色显示细胞凋亡水平明显增加,Cleaved-caspase3、RIP3、p18-FUNDC1表达上调(P<0.05).应用丹参酮IIA预处理或体外沉默RIP3表达后再次予以LPS刺激细胞,TUNEL染色显示细胞凋亡水平较LPS组明显减少,Cleaved-caspase3、RIP3、p18-FUNDC1表达水平较LPS组下降(P<0.05).结论 丹参酮IIA可能通过抑制RIP3/FUNDC1信号通路来改善LPS诱导的肾小管上皮细胞凋亡.

目的 研究心肌细胞肥大时线粒体三磷酸腺苷(ATP)敏感钾通道亚基及线粒体自噬的变化.方法 选择出生24h的大鼠乳鼠体外培养原代心肌细胞,将其随机分为 2 组.对照组细胞采用加含 10%胎牛血清的高糖培养基进行培养,模型组细胞在含 10%胎牛血清的高糖培养基中加入异丙肾上腺素(ISO)140 μmol/L处理 48 h.酶联免疫吸附法检测心肌细胞培养上清液氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)浓度,实时荧光定量聚合酶链式反应检测心房钠尿肽(ANP)、脑利钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、内向整流钾通道 6.1(Kir6.1)和自噬相关基因 8(Atg8)的mRNA表达,蛋白免疫印迹法检测Kir6.1 和线粒体自噬相关蛋白微管相关蛋白1 轻链3(LC3)和FUN14 结构域蛋白1(FUNDC1)的表达.采用GraphPad Prism v9.0.0 软件进行数据分析.组间比较采用 t 检验.结果 经 ISO 处理后,模型组心肌细胞上清液 NT-proBNP 浓度[(1699.43 ?407.01)pg/ml]显著高于对照组[(808.68 ?91.46)pg/ml],标志性肥大基因ANP、BNP 和β-MHC的mRNA表达增加,Kir6.1 和Atg8 的mRNA表达显著降低,线粒体ATP敏感钾通道蛋白Kir6.1 和线粒体自噬相关蛋白LC3,FUNDC1 表达明显下降(均P<0.05).结论 心肌细胞肥大时线粒体ATP敏感钾通道表达和线粒体自噬水平均降低.