目的:研究FcγRIIb基因修饰树突状细胞对大鼠原位肝移植术后肝功能及病理排斥反应的影响。方法:利用基因克隆技术构建含Lewis大鼠FcγRIIb基因的重组慢病毒表达载体TRE-FcγRIIb。分别包装TRE-FcγRIIb表达病毒与TET-on可诱导病毒，用其共感染DA大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞并检测FcγRIIb的表达。将供体DA大鼠与受体Lewis大鼠按照体重进行配对后随机分为三组，三组均行DA-Lewis的大鼠原位肝移植术。对照组(A组)不给予任何预处理。环孢素A组(B组)术后第2天开始给予环孢素A处理。FcγRIIb基因修饰未成熟树突状细胞组(C组)术前1 d供体大鼠静脉注射FcγRIIb修饰的DA大鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞(1×10 6细胞)。术后第7天分别取血和肝脏检测肝功能和肝脏病理变化。 结果:C组术后第7天肝功能异常明显低于对照组( P<0.05); C组术后第7天肝脏病理排斥反应明显低于对照组( P<0.05)。对照组中的大鼠平均存活天数为12.8 d；B组的大鼠平均存活天数为65.3 d；C组的大鼠平均存活天数为58.5 d。 结论:FcγRIIb基因修饰未成熟树突状细胞可以降低大鼠原位肝移植术后肝功能异常，减轻术后大鼠肝脏急性排斥反应。

(5R)-5-hydroxytriptolide (LLDT-8) is a novel triptolide analog that has been identified as a promising candidate for treating autoimmune diseases and has been shown to be effective in treating murine collagen-induced arthritis and lupus nephritis.In the present study,we investigated the therapeutic effect and possible mechanism of action of LLDT-8 in a murine anti-glomerular basement membrane (GBM) glomerulonephritis model.NZW mice were injected with rabbit anti-GBM serum (500 μL,ip).The mice were orally treated with LLDT-8 (0.125 mg/kg,every other day) or a positive control prednisolone (2 mg/kg every day) for 14 d.Blood and urine samples as well as spleen and kidney tissues were collected for analyses.LLDT-8 treatment did not affect the generation of mouse anti-rabbit antibodies.LLDT-8 significantly reversed established proteinuria,improved renal histopathology and attenuated renal dysfunction in glomerulonephritis mice.Furthermore,LLDT-8 inhibited inflammation in the kidney evidenced by significantly decreasing C3 and IgG deposition,reducing the levels of the pathogenic cytokines TNF-α,IL-6,IL-17,and IFN-γ,and reducing related chemokine expression and leukocyte infiltration in kidneys.Moreover,LLDT-8 treatment significantly increased the expression of FcγRIIB in the kidney and spleen.In addition,the treatment restored the reduced expression of FcγRIIB on the surface of kidney effector cells,CD11b+ cells,and interfered with FcγR-dependent signaling,especially FcγRIIB-mediated downstream kinases,such as BTK.These results demonstrate that LLDT-8 ameliorates anti-GBM glomerulonephritis by regulating the Fcγ receptor signaling.

目的 探讨敲除IgG受体基因(FcγRⅡB)在高脂饮食(HFD)诱导下,对小鼠全身及脂肪组织炎性反应以及脂肪组织脂代谢的影响.方法 选取FcγRⅡB+/+雄鼠和IgG受体FcγRⅡB敲除(FcγRⅡB-/-)雄鼠各10只,均给予HFD诱导,17周末处死小鼠,称取小鼠体质量,采集血和脂肪组织.用ELISA、流式细胞计量术和实时定量PCR检测炎性反应及脂代谢相关指标.结果 FcγRⅡB-/-小鼠与FcγRⅡB+/+小鼠相比,血清中炎性因子IL-6、TNF-α和IFN-γ水平明显升高(P＜0.05);脂肪组织巨噬细胞浸润显著增加(P＜0.05);M1型极化基因MCP-1、TNF-α增加( P＜0.05);M2型极化基因ARG和IL-10没有明显差异;体质量、脂肪细胞大小、脂代谢相关基因PPARG、CEBPα、FASn、HSL、ATGL、UCP-1和GLUT4的表达没有差异.结论 HFD诱导下,敲除IgG受体FcγRⅡB加重小鼠全身及脂肪组织的炎性反应,但不影响脂肪组织的脂代谢以及体质量.

目的 构建大鼠FcγRIIb慢病毒诱导表达载体,表达病毒与调节病毒共同感染大鼠骨髓来源树突状细胞(BMDCs)并检测FcγRIIb的表达.方法 提取大鼠肝脏mRNA,并以其为模板通过逆转录及PCR获得FcγRIIb基因片段,利用酶切重连技术构建慢病毒表达载体TRE与FcγRIIb重组慢病毒载体.使用HEK293T细胞分别包装TRE-FcγRIIb表达病毒与TET-on调节病毒,并检测其病毒滴度;离体诱导培养大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞并鉴定.采用OX-62免疫磁珠分选大鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(iDC),用表达病毒和可诱导病毒共感染iDC.经一定梯度的强力霉素(DOX)诱导,分别用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印记法(WB)检测BMDC中FcγRIIb mRNA水平及FcγRIIb蛋白表达水平;免疫荧光检测树突状细胞中FcγRIIb的表达;电镜对分离培养的BMDC进行形态学观察和鉴定.结果 成功构建TRE-FcγRIIb重组慢病毒载体,经酶切、PCR电泳条带鉴定成功,基因序列测定结果与GenBank比对同源性100％.体外诱导培养BMDC,5d左右观察到明显的树突样凸起.成功用慢病毒感染BMDC后,FcγRIIb mRNA和FcγRIIb蛋白水平均较未感染BMDC有明显的增高.结论 成功制备了含大鼠FcγRIIb基因慢病毒,用其感染未成熟树突状细胞并经DOX诱导可实现FcγRIIb的高表达.

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)发病过程是由多因素调控的渐进过程,分为亚临床期、急性炎症期、慢性自身免疫病期和转归期4个阶段[1](图1).B细胞作为SLE发病机制中的重要环节,其表面表达很多免疫激活和免疫抑制作用的分子.激活分子包括B细胞受体(B cell receptor,BCR)[2]、Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)[3]和B细胞表面抗原CD40[4]等.抑制分子包括Fc受体FcγRIIB (Fcγ receptor IIB,FcγRIIB)[5]和CD72[6]、程序性死亡蛋白1(programmed death 1 protein,PD-1)[7]等,这些分子所提供的信号作用于B细胞,影响B细胞活化的性质和程度,控制由此产生的B细胞亚群分化及抗体产生[8](图2).

目的 探讨类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单核细胞FcγRⅡb表达及其与骨关节损害的相关性.方法 选取2018年1月至12月本院收治的35例初治RA患者纳入观察组,并以1:1的比例配对选取同期于本院体检的35例健康成人纳入对照组.采用实时荧光定量聚合酶链反应检测两组研究对象外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA的表达水平,采用酶联免疫吸附测定检测两组研究对象血清可溶性FcγRⅡb(sFcγRⅡb)、与IgG结合的可溶性FcγRⅡb(sFcγRⅡb-IgG)和抗FcγRIIb抗体含量,分析其与RA患者改良Sharp评分的相关性.结果 观察组患者外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA表达水平、血清sFcγRⅡb、抗FcγRⅡb抗体水平均显著低于对照组(均P<0.05),血清sFcγRⅡb-IgG水平显著高于对照组(P<0.05).RA患者外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA表达水平、血清sFcγRⅡb、抗FcγRⅡb抗体水平与改良Sharp评分均呈显著负相关(均P<0.05).结论 RA患者外周血单核细胞FcγRⅡb mRNA表达水平降低与骨关节损害显著相关,或可作为判断RA病情严重程度的生物标志物.

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种自身免疫介导的慢性弥漫性结缔组织病.目前SLE的治疗主要依赖糖皮质激素及免疫抑制剂,但长期使用这些药物存在诸多难以避免的毒副作用.因此,寻找新型治疗靶点对于探索特异性更强、毒副作用更小的新疗法具有重要意义.目前对SLE治疗的研究,主要涉及B细胞/浆细胞相关靶点(如B淋巴细胞刺激因子、增殖诱导配体、CD20、CD22、CD19/FcγRIIb、Bruton酪氨酸激酶、蛋白酶体)、T细胞相关靶点(如钙调磷酸酶、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白、调节因子X1、Rho激酶)、巨噬细胞相关靶点(如巨噬细胞游走抑制因子)、细胞内信号分子(如Cereblon、组蛋白去乙酰化酶6、Janus激酶/信号转导与转录激活因子等)、共刺激因子(如CD28/B7、CD40/CD154)、细胞因子(如IL-2、IL-12/23、IL-10、IL-6、干扰素)、IgE以及肠道菌群等方面.其中,针对B细胞/浆细胞相关靶点的贝利尤单抗(人源化抗B淋巴细胞刺激因子单克隆抗体)、泰它西普(重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白)已在我国相继获批用于SLE的临床治疗.还有多种靶向治疗新药处在II期或III期临床试验阶段,其中,Anifrolumab(抗I型干扰素受体亚基1的全人单克隆抗体)已完成III期临床试验并取得良好应答,但其带状疱疹发生率高于对照组.近年来,这些针对不同靶点的基础研究和新药研发大大推动了医学界对SLE发病机制认识的深入,也反映出该病的复杂性和异质性.随着更多新疗法投入使用,未来有望迎来SLE个体化治疗的崭新局面.

目的·在单点突变文库筛选结果和多个简并引物引入组合突变的基础上,建立一种高效获得高通量的哺乳动物细胞膜表面展示IgG抗体Fc(fragment crystallizable domain)组合突变文库的方法.方法·单点突变文库经流式细胞术分选获得与Fcγ受体IIB(FcγRIIB)高亲和力的位于EU编号233～240位点的氨基酸突变;根据这些突变设计多个简并引物,将引物等比混合或按引物所包含突变多样性占比混合后进行PCR获得含有组合突变的DNA片段;利用重组酶连接片段与载体后转化大肠埃希菌DH5α,获得质粒文库;质粒文库转染Pheonix细胞,制备反转录病毒,然后感染3T3细胞,获得细胞表面表达有Fc突变的细胞文库;使用流式细胞术检测质粒转染Pheonix细胞的效率,以及病毒感染3T3细胞的效率;高通量测序评估质粒文库和细胞文库的构建情况.结果·根据单点突变文库筛选结果,设计32条简并引物,可以覆盖所有期望的组合突变,并且实际文库多样性为期望文库的3.6倍(41600/11520);高通量测序结果显示,相较于引物等比混合获得的质粒文库,按引物所包含突变多样性占比混合所获得的质粒文库具有更好的均一性与完整性,能够覆盖期望文库中99.58％的组合突变类型(11472/11520);一代测序结果显示,10条序列中有3条为期望文库突变,与简并引物设计时计算的多样性相符;流式细胞术的结果显示,Pheonix细胞的转染效率为51.6％,3T3细胞的感染效率为47.4％;高通量测序结果显示,所获得的细胞文库能够覆盖期望文库中85.92％的组合突变(9898/11520).结论·在已有单点突变文库筛选的氨基酸突变基础上设计多个简并引物,并通过PCR、质粒转染和反转录病毒感染,能够高效、低成本地获得文库覆盖率超过85％的抗体Fc组合突变质粒文库和哺乳动物细胞表面展示文库.