目的 鉴定嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中含GGDEF和EAL结构域相关蛋白的功能.为进一步研究环二鸟苷酸(c-di-GMP)在该菌株中的调控机制奠定基础.方法 从嗜酸乳杆菌ATCC4356基因组中PCR扩增出NH 13_07045-GGDEF、NH13_07050和NH13 07055这3个基因片段,分别构建其重组表达质粒.经鉴定后,转入大肠杆菌表达宿主中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经直链淀粉树脂纯化后进行体外酶活性实验,再通过高效液相色谱检测反应产物.结果 通过PCR扩增的目的基因片段经重组质粒双酶切后其大小与预期相符,测序结果与GenBank中嗜酸乳杆菌ATCC4356基因序列一致,表明重组质粒构建成功.SDS-PAGE和Western Blot检测表达的重组蛋白相对分子质量分别约为59000(含GGDEF结构域)、67000(含EAL结构域)和72000(含EAL结构域),与预期大小吻合.经树脂亲和柱纯化及浓缩获得目的蛋白.高效液相色谱分析结果显示,NH13_07045-GGDEF的表达产物体外无明显双鸟苷酸环化酶(DGC)活性,NH1307050的表达产物体外具有磷酸二酯酶(PDE)活性,而NH13 07055的表达产物在体外无明显PDE活性.结论 在本研究的3种基因中,NH13_07050的表达产物在体外具有磷酸二酯酶(PDE)的活性.为研究环二鸟苷酸在嗜酸乳杆菌中的调控机制提供了实验依据.

[目的]环二鸟苷酸c-di-GMP是细菌中广泛存在的第二信使,能够调控多种细胞功能.c-di-GMP的合成与水解分别由含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白催化.本研究针对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的GGDEF和EAL结构域相关蛋白进行基因组学分析,并对三个同时含有GGDEF和EAL结构域的蛋白(AZC_3085、AZC_3226和AZC_4658)进行功能研究.[方法]利用SMART数据库对含有GGDEF和EAL结构域的蛋白进行结构域预测.利用CLUSTALW程序对蛋白序列进行比较分析.通过同源重组的方法构建突变株,并对突变株的细胞运动能力、胞外多糖合成、生物膜形成及与豆科宿主的结瘤等表型进行测定.[结果]茎瘤固氮根瘤菌ORS571中一共存在37个GGDEF和EAL结构域蛋白.突变株△4658的运动能力较野生型有下降,但是其胞外多糖合成能力、生物膜形成能力和竞争性结瘤能力较野生型有提高.此外,实验结果表明突变株A4658的胞内c-di-GMP水平高于野生型.突变株△3085和△3226的各种表型与野生型相比没有明显差异.[结论]茎瘤固氮根瘤菌ORS571编码如此大数量的GGDEF和EAL结构域蛋白,表明c-di-GMP可能在其信号转导过程中起到非常重要的作用.同时具有GGDEF和EAL结构域的蛋白AZC_ 4658对茎瘤固氮根瘤菌ORS571的运动能力、胞外多糖合成、生物膜形成及与宿主的结瘤起到一定的调节作用.

本研究通过克隆赤红球菌SD3的二鸟苷酸环化酶(DGC)基因,并对该酶进行生物信息学分析,研究其在甲苯和苯酚胁迫下的转录水平变化,为进一步研究该酶和赤红球菌SD3有机溶剂耐受性之间的关系奠定基础.综合使用煮沸法和冻融法提取赤红球菌SD3的总DNA,利用PCR扩增和T载体克隆获得DGC基因序列;利用生物信息学手段对DGC的理化性质和结构特征进行分析;利用邻位相连法构建进化树;采用Discovery studi0 3.5将DGC与底物GTP进行分子对接;采用qPCR方法分析DGC基因在甲苯和苯酚胁迫下的转录变化情况.克隆获得了赤红球菌SD3的DGC基因序列,在GenBank中的序列登录号为MH482549.该基因的开放阅读框长为1 332 bp,编码443个氨基酸,预测蛋白分子量为46.95kD,是疏水性蛋白.无信号肽和二硫键,含有6段跨膜区,第181～316位氨基酸之间存在一个GGDEF保守结构域和c-di-GMP结合抑制位点(Ⅰ位点).亚细胞定位分析表明,DGC属于质膜蛋白.DGC中超过50％的氨基酸参与形成α螺旋结构.进化树分析表明Rhodococcus ruber SD3和Rhodococcus aetherivorans的DGC聚为一簇,推测赤红球菌SD3的DGC也属于ClassⅢnucleotidyl cyclases家族,具有类似的分子功能.分子对接表明DGC和GTP分子通过疏水作用和氢键产生相互作用.qPCR结果表明在甲苯和苯酚胁迫下,赤红球菌SD3中DGC基因的转录分别上调了1.57倍和8.71倍.研究表明,赤红球菌SD3中的DGC催化GTP产生c-di-GMP,并且DGC基因的转录在有机溶剂胁迫下发生显著上调,这暗示c-di-GMP与赤红球菌SD3的有机溶剂耐受性可能相关.

[背景]铜绿假单胞菌PAO1中存在与环乌苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575.[目的]探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响.[方法]通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达.[结果]3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(尸≮0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P＞0.05).运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P＜0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P＜0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用.生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18h后PA0575-1的生物膜含量降低(P＜0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高.最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白.[结论]PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达.以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础.

目的 采用生物信息学方法分析鲍曼不动杆菌ATCC17978中第二信使环鸟苷-磷酸(c-di-GMP)相关代谢蛋白,预测其性质和编码功能. 方法 通过在线数据库NCBI查找鲍曼不动杆菌基因组,从中筛选出含有GGDEF/EAL结构域的蛋白,通过MEGA4.0软件构建进化树进行分析,利用Swiss-Model软件分析该蛋白的三级结构. 结果 Blast比对显示ATCC17978中含有GGDEF/EAL结构域和c-di-GMP代谢相关的候选蛋白12个,其中含有GGDEF结构域的蛋白10个,含有EAL结构域的蛋白5个,同时含有GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白3个.蛋白序列分析含有GGDEF/EAL结构域的蛋白可以分为两类,其中5个蛋白质含有I位点.结构预测分析7个蛋白中含有1个或多个跨膜结构域,其中3个蛋白无跨膜结构域.三级结构预测出9个可信度较高的蛋白. 结论 鲍曼不动杆菌ATCC17978含有12个与c-di-GMP代谢相关GGDEF/EAL结构域蛋白,为探索c-di-GMP代谢网络奠定了基础.

环二鸟苷酸(cyclic diguanylate monophosphate,c-di-GMP)是一种重要的第二信使,可调节细菌的各种生命活动,包括生物膜形成、细胞分化、菌体运动和毒力因子产生等.在c-di-GMP代谢过程中,GGDEF结构域发挥重要作用.一方面,GGDEF结构域广泛存在于二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclases,DGCs)上,催化c-di-GMP的合成;另一方面,GGDEF结构域也可与EAL等结构域串联,参与c-di-GMP的分解.该文系统介绍了c-di-GMP的代谢过程及其生理作用,重点论述了GGDEF结构域有效调控c-di-GMP代谢的结构基础和机制,并讨论了该领域研究的应用价值与未来方向.