核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是光合作用中决定碳同化速率的关键酶,其中小亚基(rbcS)是由核基因编码,并且主要在叶片中表达.利用RT-qPCR技术确定了小黑杨(Populus×xiaohei)叶片中高表达的Rubisco小亚基基因PxrbcS1和PxrbcS2基因,并克隆了其上游2 240、2 174 bp的启动子.对其进行启动子元件分析结果表明,PxrbcS1和PxrbcS2的启动子具有多个与光诱导表达相关的元件,例如G-box、MRE和Box 4等元件.构建pBI-121-pPxrbcS1::GUS和pBI-121-pPxrbcS2::GUS植物表达载体并遗传转化84K杨(P.alba× P.glandulosa).GUS组织化学染色以及qPCR表达分析表明PxrbcS1和PxrbcS2的启动子能够驱动GUS基因在84K杨叶片特异性高表达.总之,上述结果表明该研究成功地从小黑杨中克隆了具有叶片高表达活性的Pxr-bcS1和PxrbcS2的启动子,该启动子可应用到包括杨树在内的植物光合作用相关的基因功能研究以及提高植物光合作用的遗传操作中.

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响.研究结果表明该菌耐盐性较好,在含 7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为 3.32 mg·mL-1.该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定.筛选获得 1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为 76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育.该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础.

'窄冠白杨1号'(Populus leucopyramidalis 1)是一种冠形窄、耐盐碱的优良白杨派无性系.由于缺乏其遗传转化体系,因此无法通过基因工程手段对其进行遗传改良.该研究以'窄冠白杨1号'为材料,建立了农杆菌介导的遗传转化体系,并获得了较高的遗传转化效率.首先将组培苗继代培养不同时间段(35、45、55、65 d),分别取其3种组织(叶片、叶柄、茎段)以对比分化能力的强弱,确定了继代45 d后的叶片具有最强的分化能力,其增殖倍数为8.77.随后,使用继代45 d后的叶片作为遗传转化的材料,研究不同侵染条件对转化率的影响,设立了菌液浓度、侵染时间和共培养时间各3个梯度的正交试验,对这3个因素进行最佳水平筛选,通过PCR检测和GUS染色鉴定转基因株系.结果表明'窄冠白杨1号'遗传转化体系的最佳组合为:菌液浓度OD600=0.4,侵染时间15 min,共培养时间2 d,在该组合下转化率最高可达54.23%.最后,利用该遗传转化体系获得了转Bt-Cry3Aa抗虫基因'窄冠白杨1号'株系,证明该体系可以做为'窄冠白杨1号'遗传改良的有效方法.

以万寿菊(Tagetes erecta)里程碑·黄色的小叶为外植体,采用农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度和抗褐化剂种类对万寿菊遗传转化效率的影响.结果表明,头孢霉素(Cef)和硫酸卡那霉素(Kan)的适宜浓度分别为100 mg·L-1和10 mg·L-1;EHA105菌株的稳定转化效率最高;菌液浓度OD600=0.1、侵染5分钟及共培养1天为最佳侵染条件.此外,在侵染过程中添加100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)和筛选培养基中添加0.2g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均能提高出芽率.经GUS染色、PCR检测以及Southern blot检测证明转化成功,转化效率达到4％左右.研究结果为万寿菊基因功能研究和转基因育种奠定了基础.

天然除虫菊酯是从除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)中提取的绿色植物源生物杀虫剂.醛脱氢酶(TcALDH)和GDSL脂肪酶(TcGLIP)是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶.为探究TcALDH和TcGLIP基因的功能,该研究从除虫菊无性系'W99'中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的启动子,并通过生物信息学分析、组织化学染色(GUS染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析.结果表明:(1)克隆得到的TcALDH和TcGLIP启动子序列分别为2 848、1 343 bp,均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件.(2)分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中观察荧光成像发现,TcALDH 启动子具有茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)激素诱导特异性.(3)用MeJA和ABA处理除虫菊'W99'组培苗发现,TcALDH的表达量在 12h内受ABA诱导时上调,受MeJA诱导时先升高后降低,TcGLIP的表达量受ABA和MeJA诱导下调.(4)分别构建了TcALDH和TcGLIP启动子与GUS基因融合的植物表达载体,转化烟草并对其转基因叶片进行GUS活性染色发现,TcALDH启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达,而TcGLIP启动子仅在烟草叶肉细胞中表达.综上认为,TcALDH和TcGLIP的启动子具有组织特异性,TcALDH启动子具有MeJA和ABA激素诱导特性.该研究结果为除虫菊TcALDH和TcGLIP基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解.

利用GUS组织化学染色法,研究由拟南芥泛素蛋白连接酶HECT家族基因(UPLs)启动子起始的β-葡萄糖苷酸酶报告基因(GUS)的表达模式.结果表明:UPLs家族中6个成员的启动子在拟南芥植株的不同组织和不同时期均有所表达,且在莲座叶发育的早期和衰老期表现出较高活性.进一步观察up l3和up l4突变体发现,up l3和up l4突变体除了up l3有较明显的叶型变化,两者均表现为延迟衰老现象;且突变体中衰老相关基因的表达水平不同于野生型.研究推测UPL3和UPL4可能参与了叶片生长发育过程的调控,同时还参与调控植株衰老进程.

Ethylene-insensitive3(EIN3)和EIN3-likel(EILl)蛋白是乙烯信号转导途径中一类重要的核转录因子.花青素是植物体中的一类水溶性天然色素,在植物的许多生理过程中起重要作用.本研究以拟南芥双突变体ein3-leil1-3为研究材料,通过RT-PCR技术确定了拟南芥双突变体ein3-1 eill-3中EIN3和EIL1基因均已被敲除,单突变体ein3-1中的EIN3基因被敲除.通过肉眼定性观察发现突变体ein3-1eil-3的种子和叶片内均呈紫色.通过紫外分光光度计定量分析发现,花青素积累量也明显比突变体ein3-1和野生型多.通过GUS染色发现EIN3启动子主要在花、柱头、成熟花粉、种子胚和果荚等组织中有较强的表达.这与突变体ein3-1eill-3的种子和叶片内均呈紫色并花青素含量增高一致.因此,拟南芥转录因子EIN3可能与EIL1共同参与抑制花青素的合成.

拟南芥(Arabidopsis thaliana)FAX1(fatty acid export 1)定位于质体内膜,向质体外运输从头合成的脂肪酸,FAX1突变显著降低了生物量和雄性育性,但FAX1影响植物雄性生殖的机制尚不清楚.我们通过花粉粒染色、正反交和花药半薄切片观察,发现FAX1突变延缓了绒毡层的降解,不但影响花粉壁发育和花粉育性,也影响授粉受精;通过GUS染色和qRT-PCR检测揭示了FAX1在花早期发育过程的表达上升模式;通过化学测定和扫描电镜观察发现FAX1突变还影响花器官表面结构的形成.综上所述,FAX1突变从多个方面影响植物雄性生殖发育.

理想的病原诱导型启动子可用来精确调控抗病基因的时空表达,消除转基因中的副作用.选用Gst1-box、W-box、S-box、F-box元件和CaMV minimal 35S启动子设计长度为374 bp的人工启动子GWSF.用GWSF替代pBI121中调控gus基因的CaMV 35S启动子后,将重组质粒导入农杆菌GV3101,并通过花序浸泡法得到转GWSF:gus拟南芥.以T4代植株为材料,GUS染色发现GWSF本底表达低,受疫霉菌、青枯菌及抗病信号分子水杨酸的诱导,但不受非致病菌大肠杆菌和逆境激素脱落酸(ABA)的诱导.序列分析发现,GWSF含有乙烯应答元件(ERE).用乙烯处理T4代转基因植株,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测GWSF的乙烯诱导活性.当乙烯浓度为0.2 mmol·L-1时,GWSF转录活性最高,达到CaMV 35S的11.33倍.结果表明,GWSF是较为理想的植物病原和乙烯诱导型启动子,具有本底表达低、诱导因子广、启动表达快、诱导效率高等优点,可用于植物转基因抗病育种.

生长素极性运输输出载体OsPIN1基因家族可能参与调控水稻根负向光性,其中OsPIN1a和OsPIN1b参与水稻根负向光性已得到证实.为了研究OsPIN1d基因与水稻根负向光性形成的关系,依据GenBank数据库中OsPIN1d (Accession number:BR000830)的核苷酸序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从水稻根尖的cDNA中扩增出完整的OsPIN1d基因全长.生物信息学分析表明,OsPIN1d的序列全长为1 497 bp,编码554个氨基酸,GC含量为64.08％;氨基酸序列多重比对及系统发育树构建表明,OsPIN1d与水稻OsPIN1b、玉米OsPIN4以及拟南芥AtPIN2、OsPIN1c、OsPIN1a和AtPIN1等基因的遗传距离较近.通过构建融合超表达载体pCAM-BIA-1301-OsPIN1d∷GFP,转化并获得其转基因水稻,经RT-PCR检测和GUS染色结果显示,外源片段已成功整合到水稻基因组内,并在根部高效表达;受单侧光照射后,转基因水稻种子的根负向光性明显大于野生型,且向光侧OsPIN1d-GFP荧光密度明显弱于背光侧.研究表明,OsPIN1d参与了水稻根负向光性的IAA和NAA的运输,从而促进了根负向光性的形成.