由细粒棘球绦虫（Eg）续绦期幼虫引起的囊型棘球蚴病（CE）是目前我国重点防控的寄生虫病之一。Eg95蛋白是一种公认的疫苗候选分子，研制载体介导的Eg95疫苗是当前CE研究热点之一。本文概述了牛痘病毒、羊口疮病毒、山羊痘病毒、狂犬病毒、鼠伤寒沙门菌、卡介苗、根癌农杆菌和两歧双歧杆菌等载体介导的Eg95疫苗的研制现状，旨在为CE的免疫预防研究提供有价值的资料。

目的:对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法:以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果:成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论:FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

猪苓菌核栽培中种苓质量不稳定是影响猪苓菌核品质和产量的关键问题,该文拟对根癌农杆菌介导的猪苓遗传转化体系进行研究,为通过分子育种从而获得优质种苓提供技术保障.采用根癌农杆菌介导法探究抗生素浓度、菌株类型、菌液浓度、受体材料、侵染时间、共培养时间和筛选条件对猪苓遗传转化效率的影响,利用潮霉素抗性标记基因、特异引物PCR以及荧光检测方法筛选并检测转化子.结果表明,根癌农杆菌GV3101菌株可对猪苓菌丝进行遗传转化,菌液浓度A600nm=0.6,受体材料猪苓菌丝,侵染30 min,共培养3 d为最佳侵染条件;9 μg·mL-1潮霉素初筛和13 μg·mL-1潮霉素复筛两步筛选法为最优筛选条件.经潮霉素抗性筛选、特异引物PCR检测和荧光检测分析,结果表明外源基因eGFP已转入猪苓菌丝内整合到基因组中并成功表达,在最优条件下,转化率可达到2.3％,遗传转化周期从大于90 d缩短到小于60 d.该研究建立并优化了根癌农杆菌介导的猪苓菌丝遗传转化体系,为解析猪苓生长发育的分子机制及分子育种奠定基础.

蒙古冰草(Agropyron mongolicum)亦称沙芦草,为禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)冰草属(Agropyron)多年生疏丛型牧草,具有饲用价值高、抗寒耐旱以及耐盐、耐瘠薄、耐风沙等特性,是改良天然草场的适宜草种与挖掘优良耐逆基因资源的重要材料.然而,目前尚未建立蒙古冰草高效遗传转化体系,制约了该物种的基因资源鉴定与遗传改良应用.以蒙农1号蒙古冰草种子为来源的高再生效率的胚性愈伤系#89为外植体,建立了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导的蒙古冰草稳定遗传转化体系,转化效率达30％.此外,针对多次继代后蒙古冰草愈伤系再生能力退化的难题,通过在再生培养基中添加1 mg·L-1 ABA或提高蔗糖浓度至45g·L-1,成功将再生能力衰退的蒙古冰草愈伤系再生效率由5％分别提高至35％与42％.研究结果为后续蒙古冰草基因编辑体系建立、基因功能鉴定和新品种培育奠定了重要技术基础.

地黄为我国传统的常用大宗中药材,具有清热凉血、养阴生津之功效.环烯醚萜苷是地黄药材的主要活性成分,环烯醚萜氧化酶是环烯醚萜苷生物合成途径的关键限速酶.该研究基于转录组数据,筛选到 1 条环烯醚萜氧化酶基因RgIO,对其进行了系统的生物信息学、表达特性和亚细胞定位分析.结果表明,RgIO的编码区为 1 536 bp,编码 511 个氨基酸,相对分子质量 58 258.01.RgIO的蛋白序列包含细胞色素P450 氧化酶的保守结构域和基序,与列当科 3 个植物独脚金、黄独脚金和大花胡麻草的同源蛋白序列一致性最高,与长春花CrIO的序列一致性也高达 77.28%.RgIO在地黄的叶中特异性高表达,而且响应茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,MeJA处理3、6 h,在叶和块根中其表达量分别增加了 3.15、1.3 倍.亚细胞定位结果显示RgIO分布在内质网上.利用根癌农杆菌介导法在地黄叶片中瞬时表达RgIO,梓醇的含量较瞬时表达空载体的对照增加了 0.82倍.该研究为地黄梓醇的分子调控和生物合成提供了关键的靶基因,也为完整解析地黄梓醇的生物合成途径奠定了基础.

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响.研究结果表明该菌耐盐性较好,在含 7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为 3.32 mg·mL-1.该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定.筛选获得 1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为 76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育.该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础.

以黑农37(感)和东农L10(抗)大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫RNA-seq数据,筛选出差异表达基因GmSBPC,对该基因编码蛋白的空间结构、蛋白理化性质、亲疏水性等进行生物信息学分析.利用抗病东农L10根系cDNA克隆GmSBPC.将含有pCAMBIA1302-GmSBPC重组载体转化至大肠杆菌DH5a、农杆菌GV3101(psoup-p19)进行亚细胞定位分析.重组pCAMBIA3300-GmSBPC转至根癌农杆菌K599进行大豆毛状根侵染.线虫土种植东农L10(抗)、东农50(感),大豆胞囊线虫胁迫处理0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d分别取根、茎、叶进行qRT-PCR分析基因表达模式.结果表明,GmSBPC蛋白编码146个氨基酸,为不溶性蛋白,α螺旋区占28.08％、延伸结构占15.75％、无规则卷曲占56.16％.亚细胞定位结果表明基因定位在细胞核中.过表达毛状根相比野生型大豆单位面积内线虫数目减少.大豆胞囊线虫胁迫下该基因在东农50和东农L10根系的表达模式为先升高后降低,整体表达水平东农L10根系＞东农50根系,东农L10根系中12 d表达量最高,该时期为线虫侵染大豆的二龄幼虫时期,因此判定该基因对线虫胁迫存在响应应答反应,推测该基因参与大豆胞囊线虫的胁迫反应.这些研究结果有助于进一步探讨SBPC基因在大豆抗胞囊线虫过程中的生理功能.

结核分枝杆菌(MTB)引起的结核病是一种慢性呼吸道传染病,研制载体介导的ESAT-6疫苗是当前的热点之一,ESAT-6抗原是一种公认的疫苗分子.本研究概述了卡介苗、耻垢分支杆菌、母牛分支杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、格式链球菌、单核细胞增生性李斯特菌、根癌农杆菌、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、毕赤酵母、流感病毒、高度减毒的牛痘病毒、腺病毒血清型5、慢病毒和昆虫杆状病毒等载体介导的结核分枝杆菌ESAT-6疫苗的研制现状.

目的 以忍冬Lonicera japonica八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase,PDS)基因为标记基因,利用ZMBJ-CMV载体建立基于病毒诱导的忍冬基因沉默体系.方法 以忍冬为材料,通过选取同源性较高的片段设计PDS基因的特异性引物,克隆出片段长度为135 bp的序列作为目的基因片段,经双酶切后与黄瓜花叶病毒载体连接构建VIGS重组载体,转化根癌农杆菌后,侵染忍冬幼苗.此外,还对农杆菌吸光度(A)值和侵染方法对PDS基因沉默效率的影响进行了比较.结果 被侵染植株叶片PDS基因表达水平显著降低,叶绿素和类胡萝卜素含量显著下降,叶片出现白化表型.结论 建立了以ZMBJ-CMV载体诱导的忍冬基因沉默体系,农杆菌A值为0.8、注射后再进行真空浸润,能够提高忍冬目标基因的沉默效率,为开展忍冬关键基因的功能研究提供了技术支撑.

环孢霉素A是一种主要由膨大弯颈霉Tolypocladium inflatum产生的环肽类次级代谢产物,临床上被广泛用作免疫抑制剂,其合成需要特殊底物(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonine(Bmt),但目前相关Bmt的研究很少.基因敲除实验证实Bmt的生物合成需要一个聚酮合酶(polyketosynthase,PKS)基因(simG)参与,并推测其功能为合成 Bmt 的前体化合物羧酸分子 3(R)-hydroxyl-4(R)-methyl-6(E)-octenoic acid(B1).本研究通过在同为虫生真菌的球孢白僵菌 Beauveria bassiana中异源表达simG,以证明该基因的功能.通过克隆获得了较大基因 simG,利用根癌农杆菌 Agrobacterium tumefaciens介导方法将该基因转化到球孢白僵菌中,通过基因检测和半定量RT-PCR筛选出目标基因表达量高的菌株,获得 4株simG高表达菌株.将其发酵培养后,利用LC-MS检测发酵产物,发现在simG高表达菌株中存在与B1分子量相同的产物峰.本研究进一步证明了simG负责化合物B1的合成,是Bmt合成的关键基因.本研究进一步加深了对环孢霉素的生物合成机理的认识,为构建Bmt高产的工程菌株提供理论支撑,有望从解决底物来源角度促进环孢霉素生产效率的提高.