目的:构建分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin融合蛋白真核表达载体，通过细胞感染模型研究其在胞内对结核分枝杆菌的杀伤效果。方法:构建原核重组质粒pET32a-LysinB并诱导表达，纯化蛋白后制备多克隆抗体；构建真核重组质粒pcDNA3.1(＋)-LysinB/Holin并转染进单核巨噬细胞RAW264.7，经制备的LysinB多克隆抗体进行表达鉴定后，建立细胞感染模型并通过抗酸染色和菌落计数检测LysinB/Holin融合蛋白的杀菌效果。结果:成功制备LysinB的多克隆抗体。重组质粒pcDNA3.1(＋)-LysinB/Holin在真核细胞中有效表达LysinB/Holin融合蛋白且对细胞无明显毒性。LysinB/Holin融合蛋白可有效杀伤胞内的结核分枝杆菌。结论:重组质粒pcDNA3.1(＋)-LysinB/Holin对胞内结核分枝杆菌有较好的杀伤效果，且对细胞无明显毒性，具有治疗结核病的潜能。

[背景]抗生素耐药问题是影响人类及养殖业健康的重要因素,噬菌体能特异性裂解细菌,成为抗生素替代品研究热点,是解决抗生素耐药难题、促进养殖业健康发展的新途径.[目的]通过研究绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体φPTK(phage target of K1)的分子生物学特性,同时利用小鼠感染模型研究φPTK对小鼠大肠杆菌感染的防治效果,为绒山羊大肠杆菌病的防控提供新策略.[方法]用聚乙二醇-氯化钠(PEG 8000-NaCl)浓缩φPTK后,采用透射电子显微镜观察其超微形态结构;运用苯酚-氯仿法提取 φPTK 核酸后通过 Illumina HiSeq 高通量测序分析其全基因组结构,使用Mauve比较基因组学分析,通过MEGA绘制噬菌体进化树;通过构建小鼠感染模型分析φPTK对小鼠感染大肠杆菌的防治效果.[结果]透射电镜显示φPTK头部为正多面体形,直径 90 nm,有长约 112 nm、直径约 18 nm的可收缩长尾;φPTK基因组全长 169688 bp,GC含量 37.72%,有264 个开放阅读框,含穿孔素-裂解酶(holin-lysin)裂解系统,有抗穿孔素蛋白和裂解抑制辅助蛋白,未发现抗生素耐药基因和毒力基因;比较基因组分析表明,φPTK为一株新的绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体;小鼠大肠杆菌感染前和感染后分别使用φPTK进行预防和治疗的试验表明,未使用φPTK的阳性对照组小鼠全部死亡,预防组和治疗组小鼠存活率分别为 80%和 60%.[结论]噬菌体φPTK是一株能够在小鼠大肠杆菌感染中具有较好预防效果的有尾噬菌体目(Caudovirales)肌尾噬菌体科(Myoviridae)绒山羊源大肠杆菌烈性噬菌体,本研究为绒山羊噬菌体生物制剂的创制奠定了基础.

目的 分离鲍曼不动杆菌噬菌体,测定其基因组DNA序列,分析预测穿孔素和裂解酶等重要功能基因及其编码蛋白的性质和功能.方法 利用双层琼脂平板法从医院污水中分离鲍曼不动杆菌噬菌体,透射电子显微镜观察噬菌体的形态特征;提取噬菌体基因组DNA,采用Illumina Hiseq2000测序仪进行全基因组测序;利用生物信息学方法对噬菌体基因组DNA序列进行功能编码基因定位、同源性分析以及对噬菌体重要功能基因编码蛋白的结构和生物功能等进行预测.结果 成功从医院污水中分离获得1株鲍曼不动杆菌噬菌体,命名为噬菌体SWH-Ab-1.噬菌体SWH-Ab-1属长尾噬菌体,对鲍曼不动杆菌具有显著裂解性.噬菌体SWH-Ab-1基因组为全长41 567 bp的双链DNA,G+C％含量为39.42％,包含51个预测功能基因,穿孔素基因和裂解酶基因分别位于噬菌体基因组的ORF02(320 ～655 bp)和ORF03(642～1 199 bp)开放阅读框,穿孔素基因序列全长336 bp,共编码111个氨基酸,其编码的HolSA1为疏水性Ⅰ型跨膜蛋白,相对分子质量为11.957 96×103,理论等电点为4.87,可能在脂肪酸代谢、转运载体及信号转导中发挥重要作用.裂解酶基因序列全长558 bp,共编码185个氨基酸,其编码的LysSA1为亲水性蛋白,相对分子质量为21.010 4×103,理论等电点为9.56,无跨膜区,可能参与氨基酸生物合成、脂肪酸代谢、辅因子生物合成等重要生理过程.两种功能蛋白均不存在信号肽序列,二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主.结论 噬菌体SWH-Ab-1是一种新分离的长尾裂解性噬菌体,其基因组的ORF02和ORF03开放阅读框是穿孔素和裂解酶的编码基因,编码的HolSA1和LysSA1可能组成“二元裂解系统”,协同参与噬菌体对宿主菌的裂解过程.

噬菌体裂解酶具有高效性、高稳定性、潜在广泛杀菌性和安全性,能特异性的杀灭细菌而且不容易使细菌产生耐药性.在有噬菌体存在的 情况下,噬菌体侵入细菌并编码产生裂解酶,裂解酶在细菌内"自内裂解"细菌,在没有噬菌体存在的情况下,穴蛋白协助裂解酶"自外裂解"细菌 .此外,本文还回顾了裂解酶对革兰阳性菌如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌,阴性菌如鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌感染的治疗新进展 .

噬菌体进化出多种裂解系统,以裂解宿主菌的细胞壁来释放子代噬菌体,并进行下一轮感染.与常见的Endolysin-Holin裂解系统不同,分枝杆菌噬菌体裂解系统由LysinA、LysinB及Holin蛋白组成.分枝杆菌具有特殊的细胞壁结构,其具有非典型的A1γ型肽聚糖,且在肽聚糖外有一层致密的分枝菌酸.LysinA可以裂解宿主菌的肽聚糖层;LysinB具有酯酶活性,裂解分枝菌酸与阿拉伯半乳聚糖之间的共价键-分枝酰阿拉伯半乳聚糖苷键;而Holin蛋白属于小分子极性跨膜蛋白,可在细胞膜形成稳定的跨膜孔.在噬菌体感染晚期,LysinA及LysinB蛋白正是通过此孔到达细胞壁发挥作用.与其他革兰阳性菌噬菌体不同,外源添加LysinA/LysinB不能有效裂解其宿主菌.本文综述了分枝杆菌噬菌体裂解系统相关蛋白的研究进展,并着重介绍了LyinA蛋白的保守的结构域,以期为分枝杆菌噬菌体及其相关蛋白的研究与临床应用带来新思路.

目的 研究多重耐药鲍曼不动杆菌噬菌体Abp1毒力蛋白穿孔素holin (holinAbp1)的生物学特性及其对细菌的毒性作用,并通过无细胞蛋白表达系统对毒力蛋白穿孔素融合蛋白进行表达.方法 利用生物信息学技术分析holinAbp1的蛋白结构特点,利用PCR技术从噬菌体Abp1基因组扩增holinAbp1基因,构建表达载体pET23b-holinAbp1-gfp并转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中以及无细胞蛋白体系中表达,利用Western印迹鉴定蛋白表达情况.结果 噬菌体Abp1的holin蛋白属于稳定疏水性蛋白,含有3个跨膜区域,属于Phage-holin-3-1家族,成功克隆了holinAbp 1-gfp基因,holinAbp1-gfp蛋白在大肠杆菌内无法正确表达,对大肠杆菌表达宿主具有明显抑制作用,而在无细胞蛋白表达系统实现了蛋白表达.结论 通过无细胞蛋白表达系统实现了holinAbp1-gfp融合蛋白表达,将为毒力蛋白的表达和噬菌体治疗药物的研发提供应用基础和技术支持.

随着抗生素耐药问题的日益加重,使得致病菌的生物防治愈发困难,新型抗菌剂的研发迫在眉睫.使用噬菌体控制致病菌重新获得了极大关注.为获取具有防治沙门氏菌潜力的噬菌体,采用双层琼脂平板法从河水中分离出一株烈性噬菌体PSM6,在肠炎沙门氏菌的菌苔可形成直径约1.5 mm-2 mm的透亮均匀的噬菌斑;具有宽裂解谱,可裂解多种血清型沙门氏菌、部分大肠杆菌和宋内志贺氏菌;最佳感染复数为0.01;繁殖活性强,潜伏期约20min,爆发量约56PFU/cell;在40-60℃、pH=5-10时,效价较为稳定.基因组核酸为双链DNA,基因组大小为90 730 bp,G+C含量为39.57％,有133个开放阅读框,含有holin-lysin裂解系统,未发现毒力因子相关基因和抗生素抗性基因.透射电镜观察和基因组测序均显示PSM6属于肌尾噬菌体科.