白细胞介素35(interleukin-35,IL-35)是非常重要的免疫抑制性细胞因子,被证实在多种疾病的免疫应答中发挥作用.本研究通过克隆人IL-35基因编码序列,构建单亚基表达载体pXC17.4-p35和pcDNA3.1(+)-EBI3,共转染CHO-K1细胞体外表达IL-35,经检测未发现p35亚基与EBI3亚基的结合.Knobs-into-Holes(KIH)可解决异源抗体重链错配的问题,因此,在原始序列的基础上融合KIH结构构建表达载体pXC17.4-p35-Fch和pcDNA3.1(+)-EBI3-Fck来表达KIH-IL-35重组融合蛋白质;同时交换2个亚基的表达载体来验证不同表达载体对KIH-IL-35表达量的影响.经过多种蛋白质检测方法的分析,显示KIH-IL-35结构的正确表达率明显提高.大量表达后对KIH-IL-35进行亲和纯化,采用ELISA法检测纯化后的KIH-IL-35与糖蛋白130(gp130)分子的结合活性,结果表明,KIH-IL-35与gp130的结合呈浓度依赖性.采用细胞活性检测方法检测KIH-IL-35与M1细胞的间接活性,结果表明,M1细胞的抑制率与KIH-IL-35的浓度呈剂量依赖性增长.此外,本研究成功建立了 一种利用激活的人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)对IL-35进行活性检测的方法,结果显示,激活的PBMCs与KIH-IL-35的浓度呈剂量依赖性增长.总之,本研究利用KIH-IL-35模型,提高了重组人IL-35的正确表达率,并验证其在体外的高活性,为IL-35的研究及类似异源二聚体细胞因子的重组表达提供新思路.

目的 构建抗表皮生长因子受体(anti-EGFR)和抗CD3(anti-CD3)的双特异性抗体(anti-EGFR/CD3),并在体外初步评价其杀伤肿瘤的功能. 方法 通过基因工程技术,利用 knobs-into-holes模式分别构建表达anti-EGFR-HC-knob、anti-EGFR-LC和anti-CD3-scFV-HC-hole的载体,共同转染 Expi 293F细胞,表达双特异性抗体,依次用抗体特异的亲和层析和分子排阻层析进行纯化,再用流式细胞仪和实时无标记细胞功能分析仪评价其体外结合能力和体外肿瘤杀伤功能. 结果 成功获得较高纯度的抗体.流式细胞仪体外结合实验结果显示,双特异性抗体能够同时与EGFR+的U87 Ⅷ脑胶质瘤细胞系、HCT-116结肠癌细胞系和CD3+的Jurkat T 淋巴瘤细胞系结合,具有2种抗体的功能,同时还能很好地激活T细胞(P<0.0001);在体外杀伤效果方面,双特异性抗体作用后杀伤效果明显高于其他抗体和对照组(均为 P<0.0001),具有很好的杀伤效果. 结论 用knobs-into-holes技术获得的anti-EGFR/CD3具有较好的生物活性,为双特异性抗体的肿瘤免疫治疗奠定了一定的基础.

目的 分析双特异性抗体杵臼结构(knobs-into-holes,KIH)的稳定性及异源重链二聚化的结合效率,为设计出更稳定的双特异性抗体奠定基础.方法 采用分子动力学模拟和泊松玻尔兹曼面积(molecular mechanics-Poisson Boltzmann surface area,MM-PBSA)方法分析KIH结构的稳定性并计算结合自由能,将其与标准结构CH3野生型(wild-type,WT)进行对照比较,并通过SDS-PAGE和银染技术观察二者的结合效率.结果 在355 K温度下CH3 WT均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)涨落小于1.0 (A),CH3 KIH波幅超过2.0 (A),主要是由于KIH knob部分3-27、45-52、70-80位氨基酸缺乏稳定性.WT和KIH中重链结合自由能分别为79.864 9 kJ/mol、107.008 2 kJ/mol,KIH的结合自由能更高,不利于两重链的结合.进一步计算结合面氨基酸结合能,找到了KIH中对结合作用贡献较小的10个氨基酸残基.银染观察KIH异源重链正确结合效率不足80％,远低于WT.结论 本研究发现双特异性抗体KIH结构的稳定性和重链结合效率均不如WT,并确定了KIH中缺乏稳定性和对结合作用贡献较小的氨基酸残基.

目的 构建可以同时靶向免疫检查点分子CD96和PD1(programmed cell death protein 1)的双特异性抗体,为肿瘤免疫治疗提供一种新的思路.方法 构建表达抗CD96和PD1的ScFv-Fc结构的质粒,使用CHO真核表达系统生产抗体.经过Protein A纯化后,使用SDS-PAGE和分子排阻色谱鉴定抗体.外源构建CHO-PD1和293T-CD96 2种靶细胞,流式细胞术检测CD96和PD 1的ScFv-Fc抗体与上述靶细胞以及T细胞上抗原的结合能力,并采用Fortebio分子互作仪进行抗原抗体结合解离动力学验证.分别采用Knobs-into-holes(KIH)突变策略构建ScFv-KIH双特异性抗体结构,以及类DVD-Ig(Dual variable domain immunoglobulin)分子结构,构建ScFv串联型(ScFv)2-Fc结构的双特异性抗体,并分别对表达的2种双特异性抗体进行了功能验证.结果 抗CD96和PD1的ScFv-Fc抗体可特异性识别靶细胞和T细胞上的靶抗原,构建生产的2种结构的双特异性抗体均能正常表达,且能同时靶向CD96和PD1 2种抗原.结论 ScFv-KIH和(ScFv)2-Fc型的双特异性抗体表达成功,并可同时识别CD96和PD1抗原.

目的:构建靶向TPBG和EGFR的双特异性抗体偶联药物(bispecific antibody drug conjugate,BsADC),并探究其在体内外抗肿瘤活性.方法:通过携带全人抗体重链可变区和共同轻链新型小鼠的RenLite技术平台获得具有共同轻链的靶向胚胎滋养层糖蛋白(trophoblast glycoprotein,TPBG,也称为 5T4)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的抗体序列,采用KIH(Knobs-Into-Holes)技术将其组装成anti-TPBG×EGFR双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb),并通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)、表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)等方法进行体外表征,最后采用半胱氨酸偶联技术将其与微管蛋白抑制剂甲基澳瑞他汀E(MonoMethyl auristatin E,MMAE)偶联成药物抗体偶联比(drug to antibody ration,DAR)为 4 的anti-TPBG x EGFR BsADC,并研究其体外杀伤作用和在人源肿瘤细胞系异种移植模型(cell derived xenograft,CDX)中的抗肿瘤活性.结果:根据GEPIA2数据库,TPBG与EGFR在多种肿瘤上具有共表达.通过对5种人源性肿瘤组织异种移植(patient-derived xenografts,PDX)免疫荧光分析也证实TPBG和EGFR在肿瘤细胞中具有不同比例的共表达.通过RenLite平台成功制备高纯度靶向TPBG和EGFR的双抗.经体外实验结果表明,BsAb相较于TPBG母本单抗显著增强了与肿瘤细胞的结合亲和力(avidity)和内吞速率.BsADC相较于TPBG母本单抗ADC明显提高了肿瘤杀伤和抗肿瘤活性.在A431(EGFRhigh/TPBGlow)模型中,anti-TPBG xEGFR BsADC体内抗肿瘤活性强于TPBG和EGFR的母本单抗ADC,表现出协同作用.另外,在NCI-H292(EGFRmoderate/TPBGlow)模型和 DU145(EGFRlow/TPBGlow)模型中,anti-TPBG×EGFR BsADC 均表现出良好的体内抗肿瘤活性.结论:实验结果表明,将TPBG与快速内化的ADC靶标EGFR组合是增强靶向TPBG的ADC内化和抗肿瘤活性的强有力策略.

双特异性抗体(双抗)可以同时特异性结合2种不同抗原,已成为抗体工程领域研究的热点.这些研究主要集中在癌症治疗方面,虽疗效显著但还未达到临床最佳状态.由于双抗有2条重链和2条轻链,因而极易出现错配.为解决这一问题,研究者设计出许多不同的双抗形式,例如串联单链抗体、双可变结构域抗体或使用“knobs-into-holes”方式构建的抗体,但仍不能得到最优的双抗.纳米抗体是目前已知最小的全功能抗体,具有许多优异的理化特性,为构建双-多特异性抗体提供了一种全新的途径.