目的:探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法:利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中 HSF1基因，构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(ARPE/Hsf1 －/－)，分别命名为H8、H9细胞株。取野生型、H8和H9细胞株，应用DHE探针染色结合流式分析技术测定细胞内活性氧簇(ROS)含量，应用流式细胞分析方法测定细胞周期；采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同培养时间点细胞活力值；采用结晶紫染色实验测定细胞相对存活率；采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验检测衰老细胞比率；采用Western blot法检测各细胞株中热休克蛋白(HSP)70、HSP27、聚集素(CLU)、p53、p21和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平；采用实时荧光定量PCR法测定各细胞株中p53、p21、IL-6、IL-8、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA表达水平。比较各细胞株在不同热休克处理条件下和HSP90抑制剂IPI504处理下热休克反应相关蛋白相对表达量，比较各细胞株不同浓度H 2O 2处理后相对存活率，比较各细胞株经或未经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后p21蛋白相对表达量。 结果:基因测序显示H8和H9细胞株成功携带突变基因，Western blot检测结果显示H8、H9细胞株不表达HSF1蛋白，HSF1在ARPE-19细胞中被成功敲除。与野生型细胞株相比，H8、H9细胞株中的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；各细胞株HSP90蛋白相对表达水平总体比较，差异无统计学意义( F＝0.29， P>0.05)。在不同热休克刺激和IPI504诱导下野生型细胞株中HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)；与野生型细胞株相比，H8和H9细胞株的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著低于相应处理的野生型细胞，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与野生型细胞株相比，H8和H9细胞株培养24、48、72和96 h的细胞活力均显著降低，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。与野生型细胞株比较，H8和H9细胞株G1期细胞百分比显著升高，细胞周期抑制因子p53、p21的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)，SA-β-gal染色阳性细胞比率显著增加，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；衰老相关炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、MCP1 mRNA相对表达量显著下降，差异均有统计学意义(均 P<0.001)。H8和H9细胞株ROS含量明显高于野生型细胞株，差异均有统计学意义(均 P<0.001)；H8和H9细胞株经NAC处理后p21蛋白相对表达量较未经NAC处理明显降低，差异均有统计学意义( P<0.05)。H8和H9细胞株200、400、600、800 μmol/L H 2O 2处理条件下细胞相对存活率明显低于野生型细胞，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:敲除HSF1可下调HSP的表达，激活ROS/P53/P21通路，诱导RPE细胞衰老，并增加RPE对氧化应激刺激的敏感性。HSF1在RPE细胞中可能具有抗衰老和抗氧化调控作用。

目的:探究类泛素蛋白FAT10对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的血管内皮炎症因子释放的作用机制。方法:选取雄性16周龄WKY大鼠3只和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、人乳腺癌细胞（MDA-MB-231）、人血管平滑肌细胞（VSMC）。使用Western blot检测大鼠胸主动脉、颈动脉、肾动脉以及上述细胞中FAT10的表达。使用HUVEC细胞筛选FAT10表达量最高时AngⅡ的浓度及作用时间。构建空白对照质粒、过表达FAT10质粒、无效干扰质粒及干扰FAT10质粒，使用上述质粒转染HUVEC细胞。在加入100 nmol/L AngⅡ培养36 h后，采用Western blot 检测炎症因子单核细胞趋向性蛋白-1（MCP-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的蛋白表达水平；采用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧生成水平；对转染空白对照质粒和过表达FAT10质粒的细胞应用活性氧清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC），采用Western blot检测应用或不应用NAC时MCP-1、TNF-α蛋白的表达水平。结果:FAT10在正常血压大鼠的颈动脉、胸主动脉、肾动脉以及HUVEC、VSMC、MDA-MB-231细胞系中均有表达。在HUVEC中，随着AngⅡ作用时间及浓度增加，FAT10的表达量逐渐增高，且在100 nmol/L AngⅡ作用36 h时达最高（ P<0.01）。在AngⅡ诱导下，过表达FAT10的HUVEC中炎症因子MCP-1（ P<0.001）与TNF-α的蛋白表达显著增加（ P<0.01），干扰FAT10的HUVEC中MCP-1与TNF-α的蛋白表达降低（ P均<0.001）。过表达FAT10的HUVEC中活性氧生成水平增加（ P<0.001），干扰FAT10的HUVEC中活性氧生成水平降低（ P<0.05）。应用NAC后，过表达FAT10的HUVEC中炎症因子MCP-1与TNF-α的蛋白表达升高趋势被逆转（ P均<0.05）。 结论:FAT10通过增加细胞内活性氧生成水平而促进AngⅡ诱导的内皮细胞炎症因子释放。

目的:探索5-羟甲基糠醛(5-HMF)影响心血管发育的机制。方法:以10、25、50 μg/ml的5-HMF处理受精8 h后的AB系斑马鱼幼鱼，用E3溶液处理同胞幼鱼作为对照组，进行形态组织学观察，吖啶橙染色检测细胞凋亡，实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测相关基因表达。用抗氧化剂N-乙酰-l-半胱氨酸(NAC)和Wnt信号通路激活剂(BML)处理幼鱼进行挽救实验，比较各组幼鱼心血管发育情况。数据比较采用单因素方差分析。结果:高浓度5-HMF处理组幼鱼心率、心包水肿程度、静脉窦-动脉球距、凋亡染色面积[(76.23±2.59)次/20 s、(65.83±3.12)%、(18.38±2.33) μm、(8 639.28±798.06)]均高于对照组[(14.39±3.41)次/20 s、(0.84±0.12)%、(14.39±0.76) μm、(1 420.84±359.34)]，差异有统计学意义( t＝9.312、8.590、11.784、9.786， P<0.05)。高浓度5-HMF处理组幼鱼心脏发育相关基因心脏特异性同源盒转录因子(nkx2.5)、T-框蛋白5(Tbx5)、锌指转录因子(gata4)和血管发育相关基因血管内皮生长因子A旁系同源基因(VEGF-A)的表达水平(0.48±0.06、0.34±0.04、0.64±0.08、0.78±0.13)均低于对照组(1.00±0.12、1.00±0.17、1.00±0.13、1.00±0.18)，差异有统计学意义( t＝5.624、4.439、5.804、6.872， P<0.05)。而凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)和p53的表达水平(2.56±0.36、3.65±0.48)均高于对照组(1.00±0.18、1.00±0.13)，差异有统计学意义( t＝7.283、6.392， P<0.05)。NAC和BML可以挽救5-HMF引起的表型异常。 结论:高浓度5-HMF提高了斑马鱼幼鱼活性氧水平，抑制Wnt信号通路的转导，最终导致斑马鱼幼鱼心血管发育异常。

目的:研究C/EBPγ在肝癌中的表达水平，探讨其对肝癌细胞增殖和迁移的相关性作用。方法:自2018年10月至2019年4月，在上海市松江区中心医院中心实验室，采用体外细胞实验，pLKO.1组为对照组，shg1组和shg2组为干扰组。采用Ocomine人类肿瘤芯片数据库（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）和荧光定量PCR比较分析C/EBPγ在肝癌组织及肝癌细胞株中的转录水平。肝癌细胞株HepG2和Hep3B采用DMEM（10% FBS）、THLE-3细胞应用BEBM加生长因子37 ℃、5%CO 2培养。构建shC/EBPγ-pLKO.1腺病毒载体，与包装载体pMD2G、pMDLG/REE和pRSV/Rev共转染293T细胞，空白载体pLKO.1作为对照，12~16 h后收集病毒上清感染HepG2细胞，重复感染4次后加入嘌呤霉素（puromycin 2 μg/mL）选择培养48~72 h，1 μg/mL嘌呤霉素维持培养，显微镜下观察细胞状态。采用生长曲线（0、2、4和6 d）检测增殖；采用无血清培养或加入抗氧化剂NAC培养0.5、1、3、6、12和24 h后，DFH-DA法检测ROS浓度，采用Real-time PCR检测氧化应激相关基因的转录水平；采用划痕实验检测细胞迁移能力。两独立样本比较采用 t检验，三组以上采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法。 结果:Oncomine数据库显示肝癌组织C/EBPγ mRNA水平明显高于正常肝组织，且肝癌分级越高，其基因组中C/EBPγ DNA重复序列拷贝数越高，荧光定量PCR结果显示肝癌细胞株（HepG2和Hep3B）C/EBPγ mRNA水平明显高于正常肝细胞株（THLE-3）。C/EBPγ干扰组4 d（shg1：1.93±0.70；shg2：1.28±0.40）、6 d（shg1：3.05±0.90；shg2：1.31±0.60）增殖显著低于对照组（4 d：6.18±0.80；6 d：22.41±2.56）（ F=1 507.971， P<0.05）；营养缺乏状态下，干扰组细胞活性氧（ROS）水平与对照组相比明显升高，干扰组氧化应激相关基因（HPRT1、NQO1-tv2和NQO1-tv4）转录水平12 h和24 h明显升高；划痕实验显示72 h干扰组（shg1∶174 922.58±1 239 376.00；shg2∶1 374 656.00±248 882.79）非愈合面积显著高于对照组（66 690.82±1 278 954.00）（ F=39.871， P<0.05）；加入NAC后，C/EBPγ组6 h细胞增殖率明显提高，0.5、1和3 h细胞活性氧水平显著降低（ F=7.587，4.657，3.903， P<0.05）。 结论:C/EBPγ在肝癌细胞高表达；降低C/EBPγ表达后，肝癌细胞增殖和迁移明显抑制、活性氧水平和氧化应激相关基因明显升高，提示高表达的C/EBPγ通过降低活性氧水平促进肝癌细胞的增殖和迁移。

[目的]为了探究草珊瑚[Sarcandra glabra(thunb)nakai]不同器官中内源激素对类胡萝卜素差异积累的可能调控机制.[方法]通过代谢组学方法分析草珊瑚中内源激素和类胡萝卜素代谢物在不同器官间的差异分布情况,结合转录组学技术挖掘草珊瑚类胡萝卜素相关差异酶基因,进一步预测参与调控差异酶基因的转录因子及其激素相关顺式响应元件,从而分析内源激素对类胡萝卜素差异积累的可能调控作用.[结果]吲哚-3-羧酸(indole-3-carboxylic acid)、反式茉莉酸[(-)-jasmonic acid]、二氢茉莉酮酸甲酯(ethyl dihydrojasmonate)、油菜素甾酮(castasterone)、油菜素内酯(brassinolide)等 7 种内源激素在叶中的含量更高,与角黄素(canthaxanthin)、海胆酮(echinenone)、新黄质(neoxanthin)和念珠藻黄素(nostoxanthin)等 8 种差异代谢物等富集部位一致;而脱落酸(abscisic acid,ABA)、赤霉素 4,5-甲氧基水杨酸(gibberellin 4,5-methoxysalicylic acid)、二氢茉莉酸(dihydrojasmonic acid)和 5,6-二羟基吲哚(5,6-dihydroxyindole)在根中的含量更高,与脱落酸醛(abscisic aldehyde)、4,4'-二聚戊烯(4,4'-aiapolycopenedial)、花药黄质(antheraxanthin)这 3 种差异代谢物富集部位一致;关键转录因子MYB106、SPL1、NAC015、ERF064、WRKY44、BHLH116 可通过响应AUX、SA、GA、ABA、Me_JA等植物激素的刺激,参与调控类胡萝卜素合成途径的DXS、VDE、ABA2、AOG、ZEP、CYP97C1、DWARF27、CRTISO、LCYB、PSY这 10 种代谢酶的表达.实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)结果表明,随机选取的 8 个差异基因表达趋势与转录组测序结果一致.[结论]筛选出草珊瑚叶和根与类胡萝卜素相关的 15 种差异内源激素与 11 种差异代谢物,预测了 6 种转录因子参与调控 10 种代谢酶.

[目的]辣椒是中国种植面积最大的蔬菜作物,随着土地盐碱化问题日趋严重,探讨辣椒耐盐关键基因的功能,加强辣椒耐盐机制研究对促进辣椒产业可持续发展具有重要意义.[方法]研究组前期挖掘到辣椒盐胁迫响应相关的NAC转录因子家族基因CaNAC36,在此基础上,以耐盐辣椒PI201224和敏盐辣椒PI438643为供试品种,克隆获得CaNAC36全长gDNA和cDNA序列,荧光定量分析CaNAC36及可能互作基因在盐胁迫条件下组织表达情况,并结合生物信息学分析探究CaNAC36及其互作基因之间的潜在关系.[结果]CaNAC36序列在耐盐和敏盐材料中DNA和cDNA同源性分别为99.86％和100％;CaNAC36在耐盐材料根和茎组织中表现为诱导上调表达,在敏盐材料根和叶中表现为诱导下调表达;对可能与CaNAC36存在互作关系的48个基因的注释信息进行分析,发现跨膜蛋白、转运蛋白、水孔蛋白、氯离子通道蛋白、解毒蛋白等14个基因可能与CaNAC36存在功能互作.在PI201224和PI438643盐胁迫处理不同时间、不同组织中,5个相关基因(Ca pana08 g002748、Ca pa-na00g004514、Capana09g000275、Capana07g001450、Capana02g001031)的表达呈显著差异;同时结合启动子分析发现CaNAC36及5个关联基因启动子域含有大量的逆境相关顺式作用元件.[结论]CaNAC36是辣椒响应盐胁迫的重要调节基因,其可能与其他基因相互作用而提高植株的耐盐性.

[目的]NAC转录因子家族是植物中研究较多的一类转录因子,在调控植物生长发育和响应非生物胁迫过程中起重要作用.玉米是三大粮食作物之一,其生长过程常会面临各种逆境胁迫,盐害被认为是限制作物生长和生产的主要环境因素之一.因此鉴定玉米抗盐基因,解析其抗盐机制对培育玉米抗逆品种具有重要意义.[方法]研究克隆了玉米转录因子ZmNAC59,并用生物信息学手段分析其保守结构域和系统进化关系,用实时荧光定量PCR方法分析该基因在NaCl和MeJA处理下的表达模式,并用稳定转基因体系将该基因异源表达拟南芥观察表型,同时还用病毒诱导沉默技术将该基因在玉米中沉默后进行盐处理表型观察,并进行酶活性检测.[结果]ZmNAC59能够被NaCl和MeJA诱导上调.病毒诱导沉默ZmNAC59后进行盐胁迫,沉默株系对盐胁迫更敏感,ROS积累更多;而ZmNAC59过表达拟南芥后,过表达株系在盐胁迫处理下存活率更高,活性氧积累更少,Na+/K+比率低,表明ZmNAC59作为盐胁迫中的正调控因子可以通过调节离子流动提高植物抗盐性.实时荧光定量PCR结果表明拟南芥过表达株系中Na+、K+转运相关的基因显著上调;在玉米原生质体中瞬时过表达ZmNAC59后进行盐处理发现ZmSOS1、ZmNHX1和ZmNHX7的表达显著上调,Dual-LUC实验表明ZmSOS1是Zm-NAC59的靶基因.[结论]研究表明ZmNAC59通过激活ZmSOS1启动子的活性调控其表达而促进盐胁迫下的离子转运,从而提高植物抗盐性,为玉米抗逆基因资源的筛选和品种培育提供了科学理论依据.

[目的]鉴定茶树NAC转录因子基因CsNAC79和CsNAC9,并分析它们在干旱、盐、高温、低温、外施ABA和外施GA3胁迫下的表达模式,为进一步解析CsNAC79和CsNAC9转录因子的生物学功能提供参考.[方法]以茶树'龙井43'为材料,用RT-PCR扩增NAC转录因子家族基因CsNAC79和CsNAC9,并进行生物信息学分析;用qRT-PCR检测CsNAC79和CsNAC9在茶树6种非生物胁迫下的相对表达量.[结果](1)CsNAC79和CsNAC9分别编码409个和282个氨基酸,且分别在15-150氨基酸位点、11-134氨基酸位点含有NAC家族成员典型的NAM保守结构域.(2)CsNAC79蛋白与中华猕猴桃、柿、洋蓟亲缘关系较近,CsNAC9蛋白与桃、荔枝、榴莲亲缘关系较近;2个NAC转录因子均是亲水性蛋白,皆不含信号肽和跨膜结构;CsNAC79和CsNAC9的启动子区域都含有非生物胁迫响应元件;蛋白质空间结构分析显示,CsNAC79和CsNAC9蛋白主要是由不规则卷曲和a-螺旋组成.(3)表达分析表明:CsNAC79和CsNAC9基因在6种不同非生物胁迫下均上调表达.[结论]茶树CsNAC79和CsNAC9基因响应多种非生物胁迫.

[目的]果实酚类物质类别、含量是与橄榄营养及风味密切相关的重要品质性状,探究橄榄酚类物质生物合成的分子调控机制.[方法]以总酚含量差异显著的橄榄(低酚/高酚)为试材,分别取花后 80-160 d的果实进行转录组分析,对莽草酸-水解单宁/苯丙烷-类黄酮生物合成通路差异基因进行表征,并对差异表达基因进行WGCNA分析,从中挖掘与酚类代谢途径相关的转录因子.[结果]转录组测序共获得 296 314 条Unigene,其中 73%的Unigene被注释到数据库;4 个品种(系)橄榄成熟果共鉴定到 1 628 个差异表达基因(DEGs),KEGG分析显示,DEGs在酚类代谢途径的"类黄酮生物合成"通路上显著富集;进一步对果实成熟过程莽草酸-水解单宁/苯丙烷-类黄酮生物合成途径的DEGs进行表征,结合WGCNA分析中每个模块与性状的R2 和P值,筛选到 4 个关键模块,根据模块内基因的调控关系利用MCC拓扑分析法以度值≥1 挖掘模块内关键转录因子,挖掘到 137 个转录因子Unigene与 30 个酚类合成结构基因Unigene共表达,转录因子Unigene功能注释来自 35 个基因家族,最多的为锌指蛋白(C2C2、C3H、C2H2、PHD),其次为B3、HB、MYB、NAC基因家族.[结论]从转录组角度初步解析了橄榄鲜食品质在酚类代谢途径的差异,同时挖掘了调控酚类代谢的差异基因,对进一步探究橄榄鲜食品质差异的分子机制提供了重要依据.

目的:探讨核转录因子NAC-1 基因沉默对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响.方法:采用LV4-LUC-GFP慢病毒转染建立NAC-1基因沉默SKOV3/DDP细胞株,将细胞接种到免疫缺陷小鼠皮下,建立人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP裸鼠移植瘤模型,给予顺铂化疗,比较NAC-1 基因沉默对SKOV3/DDP在裸鼠体内增殖的影响.取肿瘤组织进行转录组测序,利用Illumina平台进行转录组mR-NA测序,筛选差异表达基因,并进行GO和KEGG功能注释和富集分析,揭示NAC-1 基因影响移植瘤化疗敏感的可能分子机制.使用STRING数据库构建DEGs编码蛋白互作网络,筛选MCC算法、Degree 算法、Closeness 算法3 种算法共有基因作为关键基因,使用Metascape网站在线分析这些共同基因的基因功能.结果:与对照组相比,抑制NAC-1 基因后裸鼠皮下肿瘤体积变小,重量减轻,差异有统计学意义(P＜0.05).转录组学分析显示,抑制NAC-1 基因导致肿瘤组织中460 个基因显著下调,568 个基因显著上调.差异基因(DEGs)在多项 GO 富集类别中具有显著差异,如细胞代谢、有丝分裂、坏死、炎症、信号传递等.KEGG 功能富集结果显示,NAC-1 基因沉默可能影响了细胞因子-细胞因子受体相互作用、白细胞跨内皮迁移、神经活性配体-受体相互作用、细胞黏附分子、坏死、ECM受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、NF-κB信号通路等.筛选获得的关键基因主要富集在白细胞介素的信号传导、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)通路、炎症反应等通路.结论:抑制NAC-1 基因能提高人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP化疗敏感性,其可能通过多个信号通路影响肿瘤细胞的代谢、增殖、死亡、炎症反应等.