目的:探讨过表达Nkx2.5基因对骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）抗细胞凋亡能力及对心肌梗死后心功能的影响。方法:采用糖氧剥夺［低氧无血清（oxygen glucose deprivation/reoxygenat，OGD/R）］条件下培养，建立细胞缺血模型，实验分为4组：正常条件培养下的骨髓间充质干细胞组（以下简写为BMSC组）、糖氧剥夺条件下培养的BMSC组（以下简写为BMSC+OGD/R组）、糖氧剥夺条件下培养的过表达空载体BMSC组（以下简写为BMSC 空载体+OGD/R组）、糖氧剥夺条件下培养的过表达Nkx2.5 BMSC组（以下简写为BMSC Nkx2.5+OGD/R组）。采用流式细胞技术检测各组BMSC的凋亡率，并提取BMSC蛋白，采用Western Blot法检测各组BMSC中的Caspase-3及前体、Caspase-8及前体、Caspase-9及细胞色素C蛋白量及Nkx2.5的表达，明确体外抗凋亡的途径。采用结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型，实验分为五组：假手术组、心肌梗死未处理组、心肌梗死后BMSC组、心肌梗死后BMSC 空载体组、心肌梗死后BMSC NKx2.5组。通过心脏彩超评估小鼠心功能变化。正态分布的计量资料组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。 结果:BMSC+OGD/R组细胞凋亡率（12.98±1.24）%高于BMSC组（7.82±0.42）%，差异有统计学意义（ P<0.001）；BMSC NKx2.5+OGD/R组细胞凋亡率（11.26±0.22）%低于BMSC+OGD/R组（12.98±1.24）%、BMSC 空载体+ OGD/R组（13.14±0.70）%，差异有统计学意义（ P<0.05）。BMSC Nkx2.5+OGD/R组Caspase-3（0.72±0.08）及前体（0.89±0.09）、Caspase-8（0.63±0.08）及前体（0.85±0.12）、Caspase-9（0.87±0.09）、细胞色素C（0.91±0.10）、Nkx2.5（1.54±0.16）的表达与BMSC组［（0.36±0.08）、（1.13±0.04）、（0.36±0.06）、（1.12±0.13）、（1.23±0.08）、（0.60±0.05）、（0.67±0.14）］、BMSC+OGD/R组［（1.05±0.10）、（0.62±0.04）、（1.07±0.09）、（0.57±0.07）、（0.55±0.08）、（1.25±0.09）、（0.71±0.04）］、BMSC 空载体+OGD/R组［（1.16±0.16）、（0.64±0.06）、（1.19±0.16）、（0.56±0.06）、（0.50±0.06）、（1.28±0.06）、（0.73±0.04）］表达比较，差异有统计学意义（均 P<0.05）。体内实验发现经BMSC Nkx2.5组处理的小鼠心肌梗死后心脏射血分数（29.05±7.07）%较心肌梗死后BMSC组（16.57±2.09）%、心肌梗死后BMSC 空载体组（18.08±3.27）%改善明显（均 P<0.05）。 结论:BMSC Nkx2.5可能通过抑制死亡受体通路及线粒体信号通路增强BMSC抗凋亡能力，改善心肌梗死后心功能。

目的:对先天性心脏病（congenial heart disease，CHD）新发现的 TBX20基因错义突变c.785C>T（T262M）进行功能研究，进一步探寻T262M与CHD发生机制之间的相关性。 方法:①应用生物信息在线软件PolyPhen2和Mutation Taster对基因突变T262M的致病性进行预测分析。②采用同源建模技术分别构建野生型 TBX20及突变型 TBX20-T262M的蛋白质结构模型，对所构建的突变型和野生型蛋白质三维结构进行比对分析，预测突变后蛋白质空间构象的变化及影响。③通过分子模拟对接技术预测分析突变型T262M与野生型 TBX20相比较的功能变化。④采用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测野生型及突变型 TBX20 mRNA的表达情况。⑤采用双荧光素酶报告基因检测T262M对下游靶基因 ANF启动子活性的影响。 结果:①PolyPhen2和Mutation Taster软件预测结果均为T262M具有致病性，蛋白质功能可能受到影响。②同源建模显示T262M造成侧链氢键丢失，导致蛋白质构象发生改变。③分子模拟对接显示突变型T262M与 NKX2.5、 GATA4之间的结合力较野生型 TBX20提高。④实时荧光定量聚合酶链反应结果显示无论单独转染 TBX20表达质粒还是共转染 GATA4、 NKX2.5情况下，突变型T262M的mRNA表达量均明显高于野生型 TBX20，差异具有统计学意义（ P<0.05）。⑤体外细胞实验双荧光素酶报告基因检测结果显示突变型 TBX20-T262M对下游靶基因 ANF启动子活性的影响与野生型 TBX20相比差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:新发现的 TBX20基因错义突变T262M有致病性，导致蛋白质空间构象发生改变，与 NKX2.5和 GATA4结合力提高，可能通过上调mRNA表达参与CHD的发生。

目的:探索5-羟甲基糠醛(5-HMF)影响心血管发育的机制。方法:以10、25、50 μg/ml的5-HMF处理受精8 h后的AB系斑马鱼幼鱼，用E3溶液处理同胞幼鱼作为对照组，进行形态组织学观察，吖啶橙染色检测细胞凋亡，实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测相关基因表达。用抗氧化剂N-乙酰-l-半胱氨酸(NAC)和Wnt信号通路激活剂(BML)处理幼鱼进行挽救实验，比较各组幼鱼心血管发育情况。数据比较采用单因素方差分析。结果:高浓度5-HMF处理组幼鱼心率、心包水肿程度、静脉窦-动脉球距、凋亡染色面积[(76.23±2.59)次/20 s、(65.83±3.12)%、(18.38±2.33) μm、(8 639.28±798.06)]均高于对照组[(14.39±3.41)次/20 s、(0.84±0.12)%、(14.39±0.76) μm、(1 420.84±359.34)]，差异有统计学意义( t＝9.312、8.590、11.784、9.786， P<0.05)。高浓度5-HMF处理组幼鱼心脏发育相关基因心脏特异性同源盒转录因子(nkx2.5)、T-框蛋白5(Tbx5)、锌指转录因子(gata4)和血管发育相关基因血管内皮生长因子A旁系同源基因(VEGF-A)的表达水平(0.48±0.06、0.34±0.04、0.64±0.08、0.78±0.13)均低于对照组(1.00±0.12、1.00±0.17、1.00±0.13、1.00±0.18)，差异有统计学意义( t＝5.624、4.439、5.804、6.872， P<0.05)。而凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)和p53的表达水平(2.56±0.36、3.65±0.48)均高于对照组(1.00±0.18、1.00±0.13)，差异有统计学意义( t＝7.283、6.392， P<0.05)。NAC和BML可以挽救5-HMF引起的表型异常。 结论:高浓度5-HMF提高了斑马鱼幼鱼活性氧水平，抑制Wnt信号通路的转导，最终导致斑马鱼幼鱼心血管发育异常。

目的:通过胚胎干细胞发育毒性评价模型研究Cry1Ab蛋白对于细胞增殖和分化能力的影响,以评估其发育毒性.方法:设置 Cry1Ab 蛋白 7 个剂量组(31.25、62.50、125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),以5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)为阳性对照,以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)为溶剂对照,分别处理小鼠胚胎干细胞D3(embryonic stem cell line D3,ES-D3)和小鼠成纤维细胞3T3.通过CCK-8法检测细胞活性,计算受试物对于不同细胞的增殖半抑制浓度(50％inhibition concentration of growth and viability,IC50).设置Cry1Ab 蛋白 5 个剂量组(125.00、250.00、320.00、1 000.00、2 000.00 μg/L),设置溶剂对照(PBS),同时以 5-FU 为受试物进行模型验证,分别处理细胞后,通过拟胚胎体(embryonic bodies,EBs)培养法诱导ES-D3分化出心肌细胞;镜下观察EBs生长情况并测量其第3天和第5天的直径,观察并记录同批次EBs分化出搏动心肌细胞的比例,计算受试物的心肌分化半抑制浓度(50％inhibition concentration of differentiation,ID50),根据发育毒性判别函数对受试物的胚胎发育毒性进行分类;收集培养终点的EBs样本,进行实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative po-lymerase chain reaction,qPCR),检测心肌分化相关标志物(Oct3/4、GATA-4、Nkx2.5 和 β-MHC)的 mRNA 表达情况.结果:5-FU 的 IC50,3T3为 46.37 μg/L,IC50,ES为 32.67 μg/L,ID50,ES为 21.28 μg/L,根据判别函数结果将 5-FU 分类为强胚胎毒性物质.不同浓度的Cry1Ab蛋白处理组的3T3细胞和ES-D3细胞活性与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,Cry1Ab蛋白处理组分化第3天和第5天的EBs直径差异无统计学意义(P＞0.05),EBs形态也未见明显差异;不同浓度Cry1Ab蛋白处理组的心肌分化率与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05).5-FU使β-MHC、Nkx2.5和GATA-4的mRNA表达水平降低(P＜0.05),且具有剂量依赖趋势(P＜0.05),而与细胞多能性相关的标志物Oct3/4 mRNA表达水平则呈升高趋势(P＜0.05);Cry1Ab蛋白处理组的成熟心肌标志物β-MHC、心肌早期分化标志物Nkx2.5和GATA-4、多能性相关标志物Oct3/4的mRNA表达水平与对照组相比差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:本实验模型中未观察到31.25-2 000.00 μg/L的Cry1Ab蛋白具有发育毒性.

目的 研究芬太尼暴露对斑马鱼幼鱼的心脏和神经毒性及对其发育相关基因表达的影响.方法 将受精后2h(2hpf)内发育良好的斑马鱼胚胎随机分为正常对照组,芬太尼5,10和20 mg·L-1染毒组.使用体视显微镜观察斑马鱼发育中的畸形表型,24,48,72,96和120 hpf统计斑马鱼胚胎或幼鱼的畸形率,120 hpf统计幼鱼的存活率.72,96和120 hpf采用斑马鱼微视行为分析系统记录幼鱼心率,120 hpf分析心包面积和静脉窦与动脉球(SV-BA)距离.120 hpf采用HE染色观察心房心室结构和心肌细胞结构,Image J软件分析新生神经元的面积和密度,荧光定量PCR检测心脏和神经发育相关基因心脏特异性转录因子(nkx2.5)、神经元PAS结构域蛋白4a(npas4a)、心房型利钠肽原B(nnpb)和高迁移率族转录因子9b(sox9b)mRNA表达.结果 芬太尼造成斑马鱼孵化不完全、脊柱弯曲、尾部畸形和心包水肿等发育畸形.与正常对照组相比,芬太尼10和20 mg·L-1组72 hpf幼鱼的畸形率显著增加(P<0.01),芬太尼各浓度组120 hpf幼鱼的存活率无明显变化;72 hpf芬太尼20 mg·L-1组幼鱼的心率显著下降(P<0.01);120 hpf芬太尼各浓度组幼鱼的心率均显著下降(P<0.01),芬太尼20 mg·L-1组斑马鱼幼鱼心包面积和SB-BA距离均显著增加(P<0.01),心房心室明显肿大,心肌细胞层数少且薄;斑马鱼幼鱼头部新生神经元密度和面积显著下降(P<0.05,P<0.01);nkx2.5,npas4a和sox9b mRNA表达下调(P<0.01),nppb mRNA表达上调(P<0.01).结论 斑马鱼胚胎发育期间接触芬太尼导致幼鱼心脏发育畸形和心跳减缓,同时产生新生神经元毒性,可能与影响心脏和神经发育相关基因的表达相关.

目的 研究Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程的作用以及机制.方法 构建过表达Islet-1细胞模型;流式细胞计量术检测转染效率;CCK-8检测细胞增殖;Western blot检测Islet-1、cTnT和p-Akt/TA-kt蛋白表达;RT-qPCR检测心肌早期特异转录因子GA TA4、N xk2.5和Mef2c mRNA表达.结果 随着MK2-206(Akt抑制剂)浓度的增加,细胞增殖抑制率升高(P<0.05),对Akt活性的最佳抑制浓度为8nmol L/;随着Islet-1诱导分化时间的延长,感染细胞的p-Akt/T-Akt蛋白表达降低(P<0.05),心肌特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c基因的表达升高(P<0.05);而经MK-2206处理的感染细胞,GAT A4、Nk 2x.5和M fe2 c的复制在第1周时出现明显升高后又逐渐降低(P<0.05).结论 Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3 H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中于不同分化阶段发挥着不同的调节作用.

目的 探讨FGF-2与TGF-β1单独及联合诱导对骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化的影响.方法 体外分离培养SD大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定其表面抗原.分组诱导:A组(FGF-2)、B组(TGF-β1)、C组(FGF-2+TGF-β1),D组(空白对照).镜下观察细胞形态改变;免疫细胞化学染色法检测Desmin、α-sarcomeric actin、cTnI的表达;实时荧光定量PCR法检测GATA-4、Nkx2.5的表达.结果 BMSCs表面抗原CD90、CD29、CD45的阳性率分别为84.7%、86.5%、0.3%.诱导后,C组细胞以梭形及类长柱形为主,出现类肌管样结构;蛋白的阳性细胞数最多(P<0.05);GATA-4、Nkx2.5的表达量高于其余两组(P<0.05).结论 FGF-2与TGF-β1均可将BMSCs诱导为心肌样细胞,但两者联合诱导效果更佳.

目的 探讨同源蛋白NKX2.5(NKX2.5)基因突变和广西壮族人群先天性心脏病(CHD)的关系.方法 应用聚合酶链反应以及DNA测序技术,对30例广西壮族CHD患者(包括房间隔缺损组8例,室间隔缺损组10例,法洛四联征5例,右室双出口2例,大动脉转位l例,肺动脉狭窄l例)以及30正常非CHD对照者(正常对照组)的NKX2.5基因的全部外显子和侧翼序列进行突变检测,并对单核苷酸多态性(SNP)位点进行基因分型,分析单个位点的基因性和等位基因频率与CHD是否有关.结果 所有CHD患者基因编码均未发现突变,而在NKX2.5基因外显子1区域发现1个SNP位点,这个位点位于上游63位碱基63A ＞G,导致第21位密码子由GAA转变成GAG,碱基替换后仍然编码谷氨酸(Glu),属于同义突变.基因型频率和等位基因频率的分布,在CHD组和正常对照组之间差异无统计学意义(两组基因型频率比较,x2=1.725,P=0.422;等位基因频率比较,x2=1.714,P=0.190).结论 NKX2.5基因突变与我国广西地区壮族CHD之间兀明显相关,该基因上的63A＞G的SNP与先天性心脏病之间无明显相关.

目的 探讨血清反应因子全长(SRF-Full)及N端片段(SRF-N,1-254aa)对TGF-β1诱导c-Kit+心脏干细胞(cardiac stemcell,CSC)分化的影响.方法 从cDNA文库扩增大鼠SRF-Full及SRF-N表达序列并克隆入酶切线性化慢病毒载体GV358(Ubi-MCS-3 FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin),转化感受态细胞筛选出阳性克隆并测序鉴定.将SRF-Full及SRF-N过表达质粒与病毒包装辅助质粒共转染工具细胞HEK293T,包装慢病毒.磁激活细胞分选法分离乳SD大鼠c-Kit+ CSC,将SRF-Full及SRF-N过表达慢病毒感染CSC并经TGF-β1诱导,定量PCR分析下游分化基因mRNA水平的变化.结果 成功扩增出SRF-Full及SRF-N编码序列并正确连接入线性化载体,获得的阳性转化子经测序无误.将转化子质粒与病毒包装辅助质粒共转染HEK293T后,获得滴度为2×108 TU/mL的慢病毒颗粒,Western blot检测到预期Flag融合蛋白.重组慢病毒感染CSC后细胞核中见eGFP信号.TGF-β1诱导CSC出现心肌细胞分化基因(Nkx2.5、Gata4、cTnI)及平滑肌细胞分化基因(SM22α)的表达,内皮细胞分化(vWF)无影响,SRF-Full促进CSC的心肌细胞分化,而SRF-N则抑制这种分化.结论 成功构建SRF-Full及SRF-N过表达重组慢病毒质粒.SRF-Full促进而SRF-N减弱TGF-β1诱导CSC的心肌细胞分化.

先天性心脏病是一组复杂的心脏解剖学畸形,是新生儿最常见的先天性缺陷类型之一,在全世界范围内,先天性心脏病的发病率及病死率均较高,给社会及家庭带来沉重的负担.先天性心脏病的发生多是由环境因素和遗传因素共同作用的结果,目前已知染色体异常、单基因、多基因遗传缺陷,环境因素等都可以导致先天性心脏病的发生.因此,深入探究先天性心脏病的基因遗传学及环境的影响可对疾病的早期诊断及早期治疗提供新思路,为分子诊断学的发展开辟新道路.