目的:探讨常规内参基因U6和Cel-miR-39用于结核性脑膜炎患者脑脊液微小核糖核酸（miRNA）定量检测的可行性，并初步用于脑脊液miRNA定量检测分析。方法:本研究选取首都医科大学附属北京胸科医院常规脑脊液检测后保存的标本，根据最终诊断依据纳入结核性脑膜炎患者36例、病毒性脑膜炎患者34例。提取其脑脊液标本miRNA，采用TaqMan探针法检测miRNA的表达水平。采用GeNorm、NormFinder和Bestkeeper软件分析内参基因miRNA的稳定性，采用2 -ΔCt方法计算靶标miRNA的相对表达量。标本重复检测的一致性分析采用Pearson检验。靶标基因在两组间的表达差异比较采用 t检验。 结果:70份脑脊液标本中，U6检测的循环阈值（Ct）为（30.40±3.30）个循环，表达丰度较低，Cel-miR-39检测的C t值为（21.49±0.70）个循环，表达丰度适中。内参和靶标基因miRNA在重复样本检测中一致性均较好（ r>0.931, P<0.001）。根据3种软件分析结果，Cel-miR-39在70份脑脊液标本中表达稳定性更高，更适合作为脑脊液miRNA检测的内参基因。以Cel-miR-39为内参，靶标基因miR-126-3p（1.13±0.41比3.34±0.82, t=2.452, P=0.016）、miR-130a-3p（0.56±0.10比2.59±0.70, t=2.960, P=0.004）和miR-151a-3p（0.64±0.25比2.11±0.33, t=3.536, P=0.001）在结核性脑膜炎组脑脊液中的相对表达量均显著低于病毒性脑膜炎组。 结论:Cel-miR-39可作为结核性脑膜炎患者脑脊液中miRNA定量检测的标准内参，脑脊液中miR-126-3p、miR-130a-3p和miR-151a-3p的相对表达量在结核性脑膜炎患者和病毒性脑膜炎患者之间存在差异。

Objective::Optimal reference genes are critical for accurate normalization and reliable interpretation of gene expression quantification data. Recently, several strategies have been utilized for validating reference genes in different human tissues. However, no universal reference genes have been described that accurately summarize transcriptional activity in human spermatozoa.Methods::Using quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-qPCR), we evaluated ten commonly used candidate reference genes between two groups of human cryopreserved donor sperm with different pregnancy rates. We assessed the stability of reference genes using three different algorithms, namely geNorm, NormFinder, and BestKeeper. We then identified the most stable reference genes.Results::Male-enhanced antigen 1 ( MEA1) was identified as the most stably expressed reference gene, followed by testis-enhanced gene transcript ( TEGT). Conclusions::We comprehensively identified MEA1 and TEGT as the most stably expressed reference genes for the normalization of gene expression data in human spermatozoa.

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响.本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性.结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异.不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据.

本研究以皱环球盖菇Stropharia rugosoannulata不同发育时期(菌丝期、原基期、幼菇期、小菇期、成熟期)、不同组织部位(菌盖、菌柄、菌褶)和不同颜色菌盖(红色、黄色、白色)为试验材料,选择 10个内参基因(ACT、GAPDH、TEF、RPL4、PGI、PGM、RPB2、β-TUB、α-TUB、UBQ)并设计跨内含子的引物,采用实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)技术进行扩增,利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper 和 ΔCt 算法进行表达稳定性分析以及综合评价算法 ReFinder 进行加权评比,最终筛选适宜各类样本的内参基因.根据内参基因稳定性的最终排名,最适宜作为不同颜色菌盖内参基因的组合是UBQ和GAPDH,最不适宜的是ACT、PGI和TEF;最适宜作为子实体不同组织部位内参基因的组合是UBQ和RPB2,最不适宜的是ACT、RPL4 和TEF;最适宜作为不同发育时期内参基因的组合是ACT和RPB2,最不适宜的是GAPDH、α-TUB和β-TUB.

研究旨在探明梭梭(Haloxylon ammodendron)不同非生物胁迫下稳定表达的内参基因,为后续梭梭抗逆性相关基因功能研究奠定基础.采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术从梭梭转录组数据库中检测了GAPDH、EF1-α、UBC、RPL32、ALB、50S-1721、50S-1063、RPⅡ、H3、PP2A、SOD、HSC70、TUA 和TUB 14个候选内参基因在热胁迫、干旱、盐、ABA和昼夜节律条件下的表达变化,利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder软件对梭梭候选内参基因的稳定性进行评价,最终筛选出合适的内参基因,并通过对梭梭磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因表达分析,验证不同内参基因对试验结果的影响.4种软件分析得到的最优内参基因存在差异,在RefFinder网站上综合排序分析表明,在ABA处理和昼夜节律下,ALB是最优内参基因,RPⅡ基因在干旱胁迫下表达最稳定,TUB和RPⅡ基因在盐胁迫下最适用,H3基因在热胁迫下表达最为稳定.各种胁迫下最适宜的内参基因为ALB和RPL32.计算几何平均值得14个候选内参基因的综合稳定性排名,其中排名前2位的基因分别为SOD和RPL32.综上,SOD和RPL32可作为梭梭qRT-PCR标准化的内参基因.

川赤芍与芍药共同作为《中国药典》著名药材赤芍的基原植物,具有重要的药用价值,且在花卉市场的潜力巨大.筛选稳定可靠的内参基因是开展川赤芍分子研究的必要前提.该研究从川赤芍的转录组数据中选取Actin和GAPDH 2 个内参基因作为候选基因,利用实时荧光定量技术(qRT-PCR)检测 2 个候选基因在川赤芍的不同组织(韧皮部、木质部、茎、叶、叶柄、子房)和不同生长时期(萌动期、开花期、休眠期)的表达水平,然后利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT和RefFinder综合分析 2 个内参基因表达的稳定性,结果表明Actin和GAPDH在川赤芍不同组织和不同生长时期中的表达模式均稳定.该研究进一步检测川赤芍转录组数据中 8 个基因(Pv-TPS01、Pv-TPS02、Pv-CYP01、Pv-CYP02、Pv-CYP03、Pv-BAHD01、Pv-UGT01、Pv-UGT02)在不同组织中的表达水平,结果表明,以Actin和GAPDH 分别作为内参基因,8 个基因在川赤芍不同组织部位的表达趋势均一致,验证了Actin和GAPDH作为川赤芍内参基因的可靠性.综上,该研究发现Actin和GAPDH可作为川赤芍不同组织和不同生长时期中基因表达水平研究的内参基因.

本研究通过筛选桉蝙蛾Endociita signifer Walker幼虫不同龄期与不同体节中稳定表达的内参基因,为桉蝙蛾基因表达研究提供参考.通过实时荧光定量PCR技术测定5个候选内参基因(ACTIN、GAPDH、TUB、RIB、EF)在桉蝙蛾幼虫不同龄期(3龄、5龄、9龄、12龄)与不同体节(头部、胸部、腹部)及全样品(由所有样品组成)处理中的表达量,后利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper对5个候选基因的稳定性进行评估,最后由RefFinder综合分析结果,选出最佳的内参基因.基于4种分析方法的评估可知,桉蝙蛾5龄和9龄幼虫的不同体节、不同龄期幼虫的头部和胸部中内参基因的最佳数目为2,而3龄和12龄幼虫的不同体节、不同龄期幼虫的腹部及全样本中内参基因的最佳数目为3.3龄、5龄、9龄和12龄幼虫的不同体节中可分别选择ACTIN+RIB+GAPDH、EF+RIB、G4PDH+EF 和 ACTIN+RIB+GAPDH作为最稳定的内参基因组合;EF+RIB、RIB+GAPDH 和EF+GAPDH+ACTIN可分别作为不同龄期幼虫头部、胸部和腹部的最佳内参基因组合;综合考虑桉蝙蛾幼虫不同龄期与不同体节的影响时,可选择RIB、ACTIN和GAPDH作为内参基因.

目的 准确估算血迹离体时间能为刑事案件调查提供信息或线索.本文利用qPCR技术检测血迹中RNA的降解情况,进而筛选并评估适用于血迹离体时间推断的内参基因(reference genes).方法 本研究制备 10 名志愿者 0～90 d区间范围内 7 个时间节点共 70 份样本的总RNA为实验材料,基于其中 6 名志愿者的样本的qPCR数据,使用geNorm和NormFinder算法对14个候选内参基因(let-7g-5p,let-7i-5p,miR-191-5p,miR-484,miR-103a-5p,miR-423-5p,PPIA,ACTB,5SrRNA,18SrRNA,miR-93-5p,U6b,SNORD24,SNORD38B)进行稳定性评估,筛选内参基因及其使用方案.选取全部10 名志愿者70 份样本,验证内参基因及其使用方案的校正效果.结果 qPCR检测显示miRNA在血迹离体后 90 d范围内表现出的稳定性较强.综合使用geNorm和NormFinder两种算法获得的内参基因使用方案为:以let-7g-5p为单基因内参,或以let-7g-5p、U6b和miR-191-5p组合为三内参基因.70 个样本对两个内参基因使用方案的校正能力验证显示,多基因组合内参方案的三次方程模型能更准确推断血液斑迹的离体时间.结论 本研究首先推荐以ACTB为标记,以let-7g-5p、U6b、miR-191-5p组合的三内参基因三次方程校正模型用于血迹离体时间推断检验鉴定技术研发;在考虑提高检验效率、简化实验流程等需求而需要选择单基因作为内参基因时,可以选择ACTB为标记,使用let-7g-5p为内参基因的三次方校正模型.

[目的]本研究旨在通过对豌豆蚜Acyrthosiphon pisum内参基因在不同实验条件下的表达稳定性进行评估,为豌豆蚜基因表达分析奠定基础.[方法]利用qPCR测定昆虫常用14种候选内参基因(EF1α,Tubulin,NADH,RPL12,SDHB,18S rRNA,28S rRNA,16S rRNA,ATPase,Actin,TATA,RPL32,GAPDH和RPL7)在豌豆蚜不同发育阶段(1-4龄若蚜和成蚜)、有翅和无翅孤雌成蚜、孤雌无翅成蚜不同组织(头、胸和腹)、不同地理种群(美国种群、甘肃种群、云南种群和德令哈种群)的孤雌无翅成蚜、不同寄主植物(苜蓿、三叶草和蚕豆)饲养的孤雌无翅成蚜、不同光周期(24L:0D,0L:24D和16L:8D)下饲养的孤雌无翅成蚜、不同温度(4,18和35℃)下饲养的孤雌无翅成蚜和吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中的表达量;利用RefFinder,ΔCt法,GeNorm,NormFinder和BestKeeper对上述14种内参基因表达稳定性进行分析;以CYP6CY3为靶标基因,探究不同内参基因对其在吡虫啉(200 g/L)处理下孤雌无翅成蚜中表达量分析的影响.[结果]依据qPCR检测结果,通过RefFinder对ΔCt法,GeNorm,NormFinder和BestKeeper结果的综合分析显示,在不同生物条件下(发育阶段、翅型、组织、地理种群和寄主植物),18S rRNA和GAPDH是表达最稳定的内参基因,而16S rRNA和Actin的表达稳定性最差.在非生物条件下(光周期、温度和杀虫剂),18S rRNA和EF1α的表达最稳定,而Tubulin和TATA的表达稳定性最差.基于GeNorm最佳内参基因数分析和不同内参基因对靶标基因CYP6CY3表达影响的分析,推荐使用2个表达最稳定内参基因18S rRNA和EF1α用于豌豆蚜的进一步研究.[结论]在豌豆蚜qPCR分析中,推荐同时使用18S rRNA和EF1α作为内参基因.

选择合适的内参基因是准确分析目标基因表达水乎变化的重要条件.选取SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP2、GAPDH、TUB 6个常用的内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等软件分析和评价6个候选内参基因在牟细辛营养生长期、花期和花后期等不同生长阶段的根、根茎、叶片、叶柄等不同组织中的表达稳定性,筛选适宜华细辛不同生长阶段不同组织基因表达水平分析的内参基因.结果表明,18S rRNA在华细辛所有样品中表达最为稳定,是进行华细辛基因表达水平分析的适宜的内参基因.研究结果可为华细辛重要活性成分生物合成途径相美基因的功能分析,以及基因差异表达的研究提供有效的校正工具,确保基因表达分析结果的准确性与可靠性.