笔者前期研究发现,市售细辛饮片品质差异较大,炮制加工过程不规范及方法混乱是影响其品质的一个主要因素,因此本研究旨在明确炮制加工过程和方法的历史衍变及现代发展过程,明确对细辛药材品质的影响.通过整理本草文献、《中华人民共和国药典》和地方炮制规范中细辛药材的炮制加工方法,梳理了细辛药材的炮制沿革和变化,总结了细辛药材炮制的现代研究成果.上述工作明确了细辛药材炮制加工方法的传承和衍变路线,初步明确了细辛传统炮制的科学内涵,为制定工艺科学合理、参数明确的现代炮制加工工艺提供帮助.总之,细辛炮制加工历史悠久,方法众多,不同方法和工艺对药材影响显著,深挖传统炮制方法衍变及机理,有助于改进炮制工艺,提升细辛饮片品质.

目的:基于数据挖掘探讨国家专利中药复方治疗强直性脊柱炎的用药规律.方法:通过中华人民共和国国家知识产权局中专利数据库筛选有关治疗强直性脊柱炎的国家专利中药复方,利用Excel、R4.3.1、Cytoscape3.9.1等软件,采用频数分析、关联规则、复杂网络等方法进行数据挖掘.结果:共纳入275首国家专利中药复方,涉及中药411种,药物总频次4 115次.治疗强直性脊柱炎高频中药有牛膝、当归、甘草等,药物以补虚、祛风湿、活血化瘀药多见.药性以温性多见,药味以苦、辛、甘居多,多归于肝经.关联规则得到乳香-没药、黄芪-当归、杜仲-牛膝等34对药物组合.聚类分析得到狗脊-杜仲-甘草、川芎-白芍-熟地黄等6首新处方.因子分析得到川芎-乳香-没药-红花、桂枝-防风-细辛等7个因子组合.复杂网络发现核心药物组合涵盖补肾强督治偻汤、独活寄生汤等方剂.结论:国家专利中药复方治疗强直性脊柱炎常用牛膝、当归、甘草等药物,以补虚、祛风湿、活血化瘀为常用治法,临床多用补肾强督治偻汤、独活寄生汤、当归补血汤加减方辨证论治,随症加减治疗.

甲基丁香酚(methyleugenol,ME)是中药细辛Asari Radix et Rhizoma挥发油中主要活性成分之一,具有镇痛、麻醉、抗炎等功效,其在植物体内的生物合成是初始前体物苯丙氨酸在众多酶的催化下经过一系列中间产物而完成的过程.丁香酚-O-甲基转移酶(eugenol O-methyltransferase,EOMT)是其中的关键酶之一,可使丁香酚苯环 4 位上的羟基甲基化,从而将丁香酚转化为甲基丁香酚.该研究首次从华细辛Asarum sieboldii中克隆 1 条(异)丁香酚-O-甲基转移酶[(iso)eugenol O-methyltrans-ferase,IEMT]基因,其开放阅读框包含 1 113 bp,编码 1 个由 370 个氨基酸残基组成的蛋白质;该蛋白具有甲基转移酶特征性结构域,以及二聚化结构域;构建原核表达重组质粒pET28a(+)-AsIEMT,诱导目标蛋白表达并分离纯化蛋白,以及对目标蛋白进行体外酶学分析,结果表明,AsIEMT具有双重催化活性,既能催化丁香酚生成甲基丁香酚,也能催化异丁香酚生成甲基异丁香酚,但后者效率更高;以异丁香酚为底物时,酶反应动力学常数Km为(0.90±0.06)mmol·L-1,Vmax 为(1.32±0.04)nmol·s-1·mg-1.该研究拓展了对苯丙素类次生代谢关键酶基因的了解,为中药细辛品质形成机制的阐明提供了重要的研究基础.

目的:比较不同高温瞬时灭菌条件下开心散的灭菌效果,结合灭菌后样品中有效成分含量的变化,确定最佳灭菌条件.方法:采用高温瞬时灭菌法对2～8目的远志、人参、茯苓和石菖蒲4味中药的粗颗粒进行灭菌,分别考察160、165、170℃3个温度水平,灭菌时间分别为5、7、9 s.在洁净区对灭菌粗颗粒分别进行粉碎,过六号筛后均匀混合,制得开心散.参照《中华人民共和国药典》2020年版进行微生物限度检测,并采用高效液相色谱法对开心散灭菌前后的样品进行含量检测.结果:9个灭菌条件下开心散样品的需氧菌总数均小于1×104 CFU·g–1、霉菌和酵母菌总数均小于1×102 CFU·g–1.同时,控制菌项下的大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌均未检出,所有开心散灭菌样品均符合口服散剂的微生物限度要求.开心散中8个有效成分(远志酮Ⅲ、3,6′-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、茯苓酸、β-细辛醚和α-细辛醚)的含量受不同灭菌温度和时间影响.结论:结合需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌结果和有效成分含量变化情况,最终确定灭菌温度160℃、灭菌时间5 s为开心散最佳高温瞬时灭菌条件.

目的 以细辛药材为材料,采用高通量测序和生物信息学技术组装完整的叶绿体基因组序列,明确其结构特征、系统发育位置.方法 基于Illumina测序平台对细辛叶绿体基因组序列进行结构特征分析;同时,采用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建马兜铃科的系统发育关系.结果 华细辛和辽细辛叶绿体基因组全长为160 521～160 555 bp,表现出典型的四分体结构,且两者叶绿体基因组GC含量均为38.5％.细辛叶绿体基因组包含128个基因,其中85个蛋白质编码基因,34个tRNA基因,8个rRNA基因.此外,系统发育分析结果显示,基于完整的叶绿体基因组和蛋白编码数据集构建的拓扑树一致,细辛属物种和马蹄香属物种形成一个支持率的单系分支.结论 细辛叶绿体基因组测序、组装、结构特征分析,发现其大小介于 Asarum bracteolata 和 A.sieboldii var.seoulense 之间,IR 区存在 rpl16、rps19、ycf1、rpl23等基因扩张,研究结果丰富了细辛属植物遗传资源,为该属物种分子鉴定、系统发育以及野生资源保护与开发利用等研究提供理论基础.

细辛为马兜铃科植物北细辛 Asarum heterotropoides Fr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、汉城细辛Asarum sieboldii Miq.var.seoulense Nakai或华细辛Asarum sieboldii Miq.的干燥根和根茎,其主要含有挥发油类、木脂素类、黄酮类和多糖类等化学成分.现代药理学和临床研究表明细辛具有镇痛抗炎、抗氧化、抗菌、止咳平喘、抗抑郁、抗癌、降血压等多种药理活性,用于治疗风寒感冒、风湿、多种疼痛、痰饮喘咳等病症.基于对细辛的化学成分及药理作用的归纳总结,结合其质量控制研究现状,从亲缘性、特征性成分、有效性、药动学、化学成分可测性及中药配伍等方面对其质量标志物(quality marker,Q-Marker)进行预测.初步预测出马兜铃酸Na、甲基丁香酚、黄樟醚、L-细辛脂素、L-芝麻脂素、2-甲氧基-4-乙烯基酚、三甲氧基甲苯、1,8-桉叶素、β-细辛醚、卡枯醇、水鬼蕉宾碱、山柰酚等成分可作为细辛质量标志物的候选化合物,以期为建立质量标准、深入研究及综合利用等提供参考.

为探索华细辛的遗传多样性,该研究基于转录组测序结果进行SSR标记的开发,并以来自不同地区的华细辛 5 个种群为分析样本,利用GenALEx 6.5、NTSYS 2.1 和Structure 2.3.4 等软件进行遗传多样性评估.结果显示,从华细辛转录组中筛选得到的16 个多态性丰富且重复性好的SSR标记,以其两侧序列为模板设计引物,能够对华细辛5 个种群的150 个个体样本进行稳定扩增,共得到 56 个多态片段,平均每对引物扩增 3.5 个多态片段,变化范围为 2～8 个,检测到平均期望杂合度(He)、Shannon's多样性指数(I)、Nei's基因多样性指数(H)、多态性信息含量指数(PIC)的均值分别为 0.172、0.281、0.429、0.382.种群间遗传分化系数(FST)均值为 0.588,与分子方差分析(AMOVA)结果[华细辛种群间变异程度(69%)大于种群内变异程度(31%)]相一致,各种群的多态位点百分率(PPL)范围从大到小依次为SNJ>LN>SY>SZ>TB.主成分分析(PCoA)和UPGMA聚类分析进一步显示,华细辛个体样本均按地理分布进行遗传聚类,与Structure聚类分析结果一致.综上所述,从转录组中开发的SSR标记能够有效评估华细辛自然分布种群间的遗传分化程度和种群遗传结构,揭示华细辛遗传多样性较为贫乏,遗传变异主要体现在种群水平,以及种群间遗传分化程度与地理距离存在相关性.

对《伤寒杂病论》中运用细辛的方剂进行方证分析、类方对比.细辛辛温走窜,通达内外,常用于病位深、病程久、病情复杂、病邪深痼难去的阴寒性疾病,与麻黄、桂枝、附子配伍可散寒邪,与生姜、干姜、半夏、五味子配伍可化寒饮.现代研究证实细辛具有一定的呼吸毒性、肝毒性及肾毒性,故对其使用剂量作严格要求,但张仲景使用细辛剂量远大于现代临床剂量,其减毒方法主要有:药材选用华细辛根茎入药;汤剂久煎,丸剂用量极小;与生姜、干姜、芍药、五味子、甘草、蜜等药物配伍使用.

选择合适的内参基因是准确分析目标基因表达水乎变化的重要条件.选取SAND-1、ACT、18SrRNA、CYP2、GAPDH、TUB 6个常用的内参基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,通过geNorm、NormFinder、BestKeeper、DeltaCT等软件分析和评价6个候选内参基因在牟细辛营养生长期、花期和花后期等不同生长阶段的根、根茎、叶片、叶柄等不同组织中的表达稳定性,筛选适宜华细辛不同生长阶段不同组织基因表达水平分析的内参基因.结果表明,18S rRNA在华细辛所有样品中表达最为稳定,是进行华细辛基因表达水平分析的适宜的内参基因.研究结果可为华细辛重要活性成分生物合成途径相美基因的功能分析,以及基因差异表达的研究提供有效的校正工具,确保基因表达分析结果的准确性与可靠性.

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析.方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件和ExPASy在线分析等对其进行了生物信息学分析.结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的cDNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80％以上.结论:获得了AsPAL cDNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础.