绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响.本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性.结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异.不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据.

[目的]通过分析绿豆象Callosobruchus chinensis气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)CchiOBP3与绿豆Vigna radiata挥发物配体的结合特性,研究CchiOBP3在绿豆象嗅觉识别中的功能,为阐明绿豆象定位寄主的嗅觉识别机理提供理论依据.[方法]采用SWISS-MODLE软件对绿豆象CchiOBP3进行同源建模,采用SAVES 6.0软件对模型进行评估,并采用Autodock 4.2.6软件对CchiOBP3与26种绿豆挥发物配体进行分子对接模拟;通过原核表达和亲和柱层析获得CchiOBP3重组蛋白,运用荧光竞争结合实验验证CchiOBP3重组蛋白与4种高结合能绿豆挥发物配体的结合特性,并通过触角电位(electroantennogram,EAG)实验检测绿豆象雌成虫对4种挥发物配体的反应.[结果]CchiOBP3与26种配体中的17种配体形成了氢键,氢键位置主要在第112位的苯丙氨酸(phenylalanine);筛选出与CchiOBP3结合能较高的4种配体反式石竹烯、4-萜烯醇、环已基苯和2-甲基萘,CchiOBP3与其中的4-萜烯醇(Ki=7.16 μmol/L)、环己基苯(Ki=7.45 μmol/L)和2-甲基萘(Ki=13.97 μmol/L)具有较强的结合能力.此外,4种挥发物配体均能引起绿豆象雌成虫的EAG反应,且4-萜烯醇引起的反应最强.[结论]CchiOBP3可与3种绿豆挥发物配体结合,推测CchiOBP3在绿豆象定位寄主的过程中发挥着重要作用.

[目的]建立绿豆象Callosobruchus chinensis触角转录组数据库,挖掘绿豆象的基因数据.[方法]采用高通量测序平台(Illumina Hiseq)对绿豆象成虫触角进行转录组测序、序列组装及生物信息学分析.[结果]共获得51.10 Gb的clean data(NCBI SRA数据库登录号:SRP119884)及83 535条unigenes,长度在1 kb以上的unigenes有15 075条,unigenes的N50为1 492 bp.使用BLAST软件将绿豆象触角Unigene序列与公共数据库比对,共注释到22 148条unigenes,其中NR数据库注释的unigenes最多,为18 744条,且与赤拟谷盗Tribolium castaneum的相似基因最多,达39.57％.通过GO数据库注释,将unigenes功能分为细胞组分、分子功能与生物学过程三大类54个分支,其中参与代谢进程以及结合与催化活性的unigenes比例较大.KEGG代谢途径分析表明,9 084条unigenes形成289条代谢通路,其中核糖体代谢通路所含unigene最多,为516条.进一步基因注释分析筛选到140个嗅觉相关基因,包括12个气味结合蛋白(odorant binding protein,OBP)基因,4个化学感受蛋白(chemosensory protein,CSP)基因,116个气味受体(odorant receptor,Or)基因,1个离子型受体(ionotropic receptor,IR)基因和7个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membraneprotein,SNMP)基因,并用FPKM值对基因表达量进行评估.[结论]本研究获得了绿豆象触角转录组数据,为进一步研究绿豆象的基因功能分析及嗅觉感受机制奠定分子基础.

为明确蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶活性的影响,采用室内人工接虫和生化测定的方法,研究了在离体条件和饲喂条件下4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫中肠蛋白酶的抑制作用,并测定了绿豆象幼虫取食不同含量的绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)的人工绿豆后,其中肠内总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性的变化.结果表明:在离体条件下,供试4种蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫总蛋白酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶活性均有明显的抑制作用,且浓度越大,抑制效果越显著,其中以20μg·mL-1的MBTI对3种酶活性的抑制效果最强,3种酶活性分别比对照降低了62.5％、41.2％和38.7％,而卵粘蛋白抑制剂(OI)抑制效果最弱.绿豆象幼虫取食含不同抑制剂的人工绿豆后,中肠内3种酶活性也均受到一定的抑制作用,取食后随龄期的延长,3种酶活性有所升高但仍显著低于对照,且以MBTI的抑制作用最强.当绿豆象幼虫取食不同含量MBTI的人工绿豆后,随MBTI含量的增加,对总蛋白酶活性和类胰蛋白酶活性的抑制作用均逐渐增强,但对类胰凝乳蛋白酶活性的抑制作用并不显著,只有当MBTI含量达20％时,对类胰凝乳蛋白酶活性才表现出明显的抑制作用.

为寻找抗绿豆象绿豆种子中的重要抗虫成分,以抗虫绿豆晋绿7号、B20及感虫绿豆潍绿2117为试验材料,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和质谱技术,对抗、感虫绿豆中差异蛋白及功能进行了鉴定与分析.结果表明,抗、感虫绿豆中差异蛋白表达量超过2.5倍的点共有15个.其中6个蛋白点通过数据库得到了成功鉴定,涉及3种蛋白质,分别为8S球蛋白(α亚型和β亚型)、核酮糖l,5-二-磷酸羧化酶/加氧酶(RuBis CO)亚基结合蛋白和合成淀粉酶与胰蛋白酶两种抑制剂的前体多肽链.蛋白点B49(即8S球蛋白α亚型)和B31 (RuBis CO亚基结合蛋白)在抗、感虫绿豆中的差异表达量分别达到10 000倍和23倍.抗虫绿豆中8S球蛋白α亚型及β亚型、RuBis CO伴侣蛋白及胰蛋白酶抑制剂的前体作为抗虫物质影响了绿豆象的生长发育甚至导致其死亡,与抗虫性的量效关系及联合效应还需进一步验证.

以来自21个国家和地区的481份绿豆种质资源为试验材料,通过3个年度4个试点的主要农艺性状评价,分析了9个质量性状和12个数量性状的遗传变异水平.结果 表明:481份绿豆种质资源的主要表型性状变异丰富.不同环境条件下12个数量性状变异系数为5.32％～76.18％,其中小区产量、单株荚数等性状变异系数较高;遗传多样性指数为1.573～2.078,其中株高、百粒重等性状遗传多样性指数较高;相关性分析发现生育期与株高、主茎节数和主茎分枝均呈显著或极显著的正相关,说明生育期对绿豆形态建成具有重要的作用;聚类分析将481份种质材料聚为4大类群,其中第1类群多为矮秆、直立、大籽粒以及早熟种质,可作为育种的优异亲本材料.如大粒种质C06287、洮绿3号、VC4059A和苏绿1号的百粒重均在6.50g以上,可作为改良绿豆籽粒大小的材料加以利用;早熟种质C01075、C01234、C01249在4个试点都表现出生育期较短,可作为发掘早熟基因的亲本材料;矮秆种质辽绿28号、VC1562A和潍9002-341,可作为抗倒伏育种研究的亲本材料;高抗豆象种质如C05199、C05202和C05528,可作为绿豆抗豆象育种的亲本材料.通过对数量性状进行主成分分析,6个主成分因子对表型变异的累计贡献率达到了83.41％.本研究通过综合评价481份绿豆种质资源的遗传多样性,旨在为绿豆的遗传育种和种质创新提供理论基础.

[目的]为明确短时高温对绿豆象Callosobruchus chinensis (L.)各虫态及其后虫态生长发育与繁殖能力的影响.[方法]以27 ℃饲养的绿豆象为对照,在30、33、36、39、42和45℃条件下分别对绿豆象卵、幼虫、蛹和成虫进行3h的短时高温处理.[结果]短时高温对绿豆象卵的孵化率、幼虫的化蛹率和蛹的羽化率均有显著影响,但对卵和幼虫的后续发育影响不显著;幼虫耐高温的能力最强,经短时高温处理后化蛹率均在90％以上;蛹经45 ℃短时高温处理后虽表现出较高的羽化率,但羽化后成虫的寿命和产卵量均显著降低.卵期、幼虫期和成虫期绿豆象对短时高温的耐受性均有性别差异,其中,卵期和蛹期雄虫耐热性强于雌虫,成虫期雌虫强于雄虫.短时高温处理对绿豆象成虫的繁殖能力影响显著,经45 ℃处理后成虫的产卵量为32.30粒/头,显著低于对照.[结论]39℃以上的短时高温对绿豆象处理虫态及雌雄性别比有明显的影响,对其后虫态发育的影响仅见高温处理蛹后导致成虫繁殖能力下降.

[目的]明确绿豆象Callosobruchus chinensis幼虫的龄期,了解其末龄幼虫头部感受器的种类、形态和分布.[方法]测量绿豆象幼虫体长、头壳宽和上颚宽,根据所得数据的频次分布图、关系拟合结果和戴氏法则确定绿豆象最佳分龄指标,明确幼虫虫龄数,并利用Crosby生长法则和线性回归的方法进行验证;采用扫描电镜对末龄幼虫头部形态及感受器进行观察.[结果]绿豆象体长、头壳宽和上颚宽的频次分布均呈显著的4个峰,因此推断绿豆象幼虫为4个虫龄.各龄的体长变幅分别为1.581 ～ 2.556,2.406～3.381,3.381 ～4.281和4.206 ～4.881 mm,头壳宽度变幅分别为0.444～0.689,0.654 ～0.934,0.934 ～1.179和1.144 ～1.389 mm,上颚宽变幅分别为0.080 ～0.256,0.234～0.344,0.322 ～0.542和0.542～0.652mm.体长、头壳宽和上颚宽均符合戴氏法则和Crosby生长法则,并呈现明显的线性关系,因此体长、头壳宽和上颚宽可作为绿豆象幼虫龄期划分的重要指标.头壳宽的Crosby指数均小于体长和上颚宽的Crosby指数,且头壳宽与体长测量值的对数值与幼虫龄期的相关系数要优于上颚宽测量值的对数值与幼虫龄期的相关系数,因此可将头壳宽作为最佳分龄指标.绿豆象末龄幼虫头部感器共有锥形感器、毛形感器、瓶形感器、刺形感器、板形感器、栓锥形感器和坛形感器7种感器,主要分布于触角、下颚须、上唇和上颚.[结论]绿豆象幼虫分龄形态指标和头部形态观察为研究其行为活动及综合防治提供理论基础.

[目的]蛋白酶抑制剂是广泛存在于植物体内的一类分子量很小的蛋白质,通过影响昆虫体内酶活性,从而抑制幼虫的生长发育.本研究旨在明确绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)对绿豆象Callosobruchus chinensis生长发育及体内酶活性的影响.[方法]采用室内人工接虫方法,测定了取食含2.0％MBTI的人工绿豆对绿豆象生长发育的抑制作用;并利用生化方法测定了绿豆象幼虫取食含不同浓度(0.5％,1.0％,1.5％和2.0％)MBTI的人工绿豆后,其体内解毒酶羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)及保护酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的变化.[结果]绿豆象幼虫取食含2.0％MBTI的人工绿豆后,幼虫体重和成虫羽化率均显著低于对照(取食感虫绿豆品种磨制的人工绿豆),分别只有对照的72％和55％,幼期发育历期相对延长,为对照的1.083倍,而着卵量和卵孵化率并未受到显著影响;取食MBTI含量不同的人工绿豆对各龄期幼虫体内CarE,GSTs和POD活性均有一定的促进作用,而对各龄期幼虫体内SOD和CAT活性均有一定的抑制作用,抑制作用和促进作用均随MBTI含量增加而逐渐增强,且2.0％MBTI对1龄幼虫体内CarE,GSTs和POD活性的促进作用均最强,分别比对照增加了46.5％,60.5％和67.3％,2.0％MBTI分别对4龄幼虫体内SOD活性和1龄幼虫体内CAT活性的抑制作用均最强,分别为对照的80.0％和47.6％.[结论]绿豆胰蛋白酶抑制剂对绿豆象幼虫体重和成虫羽化率均有一定抑制作用,导致幼期发育历期相对延长,同时影响其体内解毒酶和保护酶活性,从而使绿豆象幼虫不能正常生长发育.

假死是昆虫重要的防御行为,与生存策略密切相关.昆虫受到天敌或类似天敌的外部物理刺激时,足、触角等附肢收缩,强直静止,自发进入假死状态.近年来,昆虫假死行为相关的研究逐渐增多,进展明显,明确了多种昆虫假死的发生时间、发生频率、刺激方式和诱发因素等特征,涉及臭椿沟眶象Eucryptorrhynchus brandti、赤拟谷盗 Tribolium castaneum、绿豆象 Callosobruchus chinensis、马铃薯甲虫 Leptinotarsa decemlineata、甘薯象甲 Cylas formicarius、毛健夜蛾Brithys crini、长壮蝎蝽Laccotrephes robustus等40种昆虫;但昆虫假死行为的发生机制仍未明确.随着技术的发展,从昆虫生理学(生物胺)、神经生物学甚至分子生物学角度研究昆虫假死行为机制成为可能.本文总结了近年来国内外关于昆虫假死行为的研究成果,重点介绍了昆虫假死行为发生机制方面的进展,指出了存在的问题和今后需要进一步研究的方向.