目的:利用布鲁菌Omp31的单克隆抗体，初步建立布鲁菌抗原流式细胞术（FCM）检测方法，分析该方法在人布鲁菌病（简称布病）临床样本检测中的价值。方法:牛种布鲁菌2308、104M、S19，羊种布鲁菌M5-90和猪种布鲁菌S2共5个菌株，经超声破碎，获得其菌液上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和蛋白免疫印迹法（Western blot），检测已制备的抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3对上述5个菌株的识别能力。构建Omp31重组真核表达载体（pcDNA3.1-Omp31）并转染人胚肾细胞（293FT细胞），Western blot检测Omp31蛋白的表达。羊种布鲁菌弱毒疫苗株M5-90侵染人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞），构建含菌单核吞噬细胞。将5H3抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）标记，采用FCM，利用FITC-5H3抗体检测pcDNA3.1-Omp31转染293FT细胞和含菌单核吞噬细胞，鉴定该抗体对细胞内布鲁菌抗原的识别能力，初步建立FCM的检测方法，并测定FITC-5H3抗体在FCM中的灵敏度。利用双抗体（PE-5H3和FITC-CD14）的流式细胞染色测定人外周血单个核细胞（PBMCs），分析该方法应用于人布病临床检测的可行性。结果:抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3不仅能识别羊种布鲁菌M5-90菌株和猪种布鲁菌S2菌株，还能识别缺失Omp31基因的牛种布鲁菌2308、104M、S19菌株。FITC-5H3抗体可用于流式细胞染色识别细胞内的布鲁菌抗原，表达Omp31的293FT阳性细胞比例约为59.3%，疫苗株M5-90侵染的THP-1阳性细胞比例约为6.2%，检测293FT阳性转染细胞的灵敏度为4%。初步建立了基于PE-5H3和FITC-CD14的双抗体染色的FCM检测方法，该方法检测布病患者PBMCs中的双抗体阳性细胞比例（1.93%）高于健康人群（< 0.30%，阴性）。结论:利用FCM，初步建立了荧光素标记抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3检测细胞内布鲁菌抗原的方法，并发现5H3抗体能识别牛种布鲁菌，弥补了布鲁菌抗原检测中Omp31的应用缺陷。此方法的建立为布病病原学检测方法的研究提供了新策略，为检测试剂的开发提供了新材料。

目的 探讨磷酸铝(AP)和氢氧化铝(AH)佐剂对布鲁菌外膜蛋白31(Omp31)诱导产生体液、细胞免疫反应以及免疫保护作用的影响.方法 制备AP佐剂以及AH佐剂,并与纯化的布鲁菌Omp31进行混合吸附,检测吸附率;将AP、AH吸附完成的Omp31蛋白分别于0、2、4周腹腔注射免疫BLAB/c小鼠,同时设立未吸附佐剂的Omp31蛋白免疫组与PBS免疫组作为对照.分别于0、2、4、6周ELISA检测小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a水平以及生殖道分泌物分泌型IgA (sIgA)水平;于第6周取小鼠脾细胞体外培养,Omp31刺激细胞48 h后,ELISA检测培养细胞上清中γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)水平,CCK-8法检测小鼠淋巴细胞增殖情况;小鼠于第6周用布鲁菌强毒株进行攻击,并分别于攻击后1周、2周检测小鼠脾脏组织菌体含量.结果 AP、AH佐剂对于不同浓度Omp31吸附率分别可达到70％与85％以上;ELISA结果显示AP组与AH组诱导产生的血清IgG、IgG1、IgG2a以及生殖道sIgA水平均在末次免疫2周后到峰值,其中AH组高于AP组,且均显著高于对照组;CCK-8实验结果显示AH组诱导的淋巴细胞增殖显著高于AP组,且均高于对照组,AH组脾细胞上清中的IFN-γ水平显著高于AP组,而IL-10水平无显著差异;强毒株16M攻击后2周,AH组小鼠脾脏菌体载量显著低于AP组.结论 AP佐剂以及AH佐剂均能有效增强布鲁菌Omp31的免疫原性及其抗感染保护作用,且AH佐剂效果好于AP佐剂.

目的:研究OMP31表位的抗原性和免疫应答特点,为布鲁氏菌表位疫苗的研制奠定基础.方法:利用生物信息软件筛选OMP31 T-B联合优势抗原表位,进一步合成肽段.用OMP31肽段免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平,ELISPOT检测脾淋巴细胞中IFN-γ阳性的T淋巴细胞活化情况.结果:用OMP31合成肽段免疫BALB/c小鼠4次后,小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平升高,小鼠脾淋巴细胞集落形成单元(SFU)增高.结论:OMP31 T-B联合表位抗原能增强小鼠Th1免疫应答和体液免疫应答,可以作为布鲁氏菌病的候选疫苗.

目的 建立一种能快速检测布鲁菌的实时荧光定量PCR (RT-PCR)初步筛查方法 .方法 根据编码布鲁菌外膜蛋白omp10和omp31的碱基序列设计4对引物和对应探针,即omp10、omp10-1、omp31和omp31-1,应用实时荧光定量PCR技术,将设计的引物和探针分别用于检测6个种类的19份已知生物型的标准布鲁菌株DNA、10份云南玉溪分离的布鲁菌株DNA和224份阴性对照菌株DNA,包括35份巴尔通体菌、103份小肠结肠炎耶尔森菌(其中包括4份0∶3型和9份0∶9型)和86份杂菌,根据检测结果评价引物和探针的特异性.结果 omp10、omp10-1可对19种标准布鲁菌株DNA进行扩增,omp10的起峰时间和扩增曲线优于omp10-1,且omp10不能扩增阴性布鲁菌株的DNA;omp31-1可对16种标准布鲁菌株DNA进行扩增;omp31不能扩增标准布鲁菌株DNA.omp10、omp10-1和omp31-1检测10份玉溪分离的布鲁菌株,DNA的平均循环(Ct)值分别为:19.87,、19.14、17.52.结论 omp10特异性强,只对布鲁菌有特异性扩增,可用于布鲁菌的快速检测.

目的 对北京地区分离自布病患者血液的2株布鲁菌进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)及其遗传学特征进行研究,为布病的预防和控制提供科学依据.方法 应用布鲁菌属特异性PCR(BCSP31-PCR)和种/型特异性PCR(AMOS-PCR)对分离的2株布鲁菌进行鉴定,采用MLST技术对2株布鲁菌分离株的19个管家基因、1个外膜蛋白基因及1个基因间区的序列进行测定,与MLST数据库中的等位基因序列进行比对,确定菌株的等位基因谱及9位点和21位点序列型(sequence type,ST).采用聚类分析法研究2株菌ST型与各种布鲁菌已知ST型的遗传进化关系.结果 2株分离株经BCSP31-PCR鉴定为布鲁菌属细菌,AMOS-PCR鉴定为非羊种、非牛种1、2、4型、非猪种1型、非绵羊附睾种布鲁菌;MLST分析显示,2株菌的等位基因编号(gap /aroA/glk /dnaK /gyrB /trpE/cobQ/int-hyp /omp 25/prpE/caiA/csdB/soxA/leuA/mviM/umC/fbaA/ddlA/putA/mutL /acnA)分别为2、1、2、2、1、3、1、4、1、13、2、2、2、2、1、1、3、7、6、2、3和2、1、2、2、1、3、1、4、29、13、2、2、2、2、1、1、3、7、6、2、3,比对MLST数据库,结果显示这2株细菌的等位基因编号组合未见报道,为新ST型.聚类分析显示这2种新的ST型与牛种布鲁菌ST型处于同一分支.结论 北京地区分离的2株布鲁菌为新ST型牛种布鲁菌,已被MLST数据库确认,分别命名为ST74和ST75(9位点序列型)与ST108和ST109(21位点序列型).与同属牛种布鲁菌的ST型遗传关系最近,该结果为北京地区布病的预防和控制提供了科学依据.

目的 为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法.方法 本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测.结果 纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性.以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4∶1、抗原最佳包被浓度为10μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1∶50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测.结论 研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测.

目的 通过对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌携带耐药基因和分子流行特点及膜孔蛋白OmpK35、OmpK36基因转录水平、膜孔蛋白表达情况分析,了解膜孔蛋白OmpK35、OmpK36在耐药机制中的作用.方法 对32株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌,进行M LST基因分型;利用PCR技术对产碳青霉烯酶,头孢菌素酶、超广谱β内酰胺酶相关耐药基因和膜孔蛋白Omp K35、OmpK36基因进行检测,并对OmpK35、OmpK36基因进行序列分析;实时荧光定量RT-PCR检测膜孔蛋白OmpK35、Omp K36基因转录水平,用SDS-PAGE检测膜孔蛋白的表达情况.结果 32株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌M LST分型,29株为ST11、2株ST15、1株为ST2193;PCR检测出31株K PC-2阳性,1株NDM-1阳性,32株都检出SHV,其中一株同时检出OXA-48基因.OmpK35、OmpK36基因序列存在点突变、单个碱基和小片段缺失;OmpK35、OmpK36基因转录水平与肺炎克雷伯菌ATCC 13883相比,转录水平不一,大部分明显上调;SDS-PAGE未检测有膜孔蛋白OmpK36缺失株.结论 产K PC-2、NDM-1型碳青霉烯酶是导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药耐药并表现多药耐药的主要原因,而膜孔蛋白Omp K35、OmpK36在其耐药中作用未体现.

目的 观察嗅觉训练对3-甲基吲哚(3-methylindole,3-MI)诱导的嗅觉障碍小鼠嗅觉功能的影响.方法 31只雄性BALB/c小鼠采用随机数字表法随机分为3组,对照组(A组)10只,嗅觉障碍组(B组)10只,嗅觉障碍+嗅觉训练组(C组)11只.B组及C组小鼠腹腔注射150 mg/kg的3-MI以诱导嗅觉障碍模型,A组注射同体积玉米油.造模后第1天起C组小鼠使用4种嗅素进行经鼻雾化吸人,B组小鼠使用4组蒸馏水进行雾化吸人,均2次/d,30 min/次/种嗅素,连续训练28 d.A组不予处理.于造模前及造模后第7、14、21、28天行觅食实验,以觅食时间评估小鼠嗅觉功能的变化.造模后第28天处死小鼠取嗅黏膜,免疫组织化学染色检测嗅黏膜上嗅觉标记蛋白(OMP)阳性的数量及嗅上皮厚度,评估嗅觉训练干预效果.采用SPSS 23.0统计分析软件进行处理.结果 造模前各组小鼠均无嗅觉障碍;造模后第7、14、21、28天,C组小鼠觅食实验时间均短于B组,差异有统计学意义[(175.88±100.50)s比(266.73±46.83)s,(132.00±84.62)s比(264.10±48.50)s,(103.57±77.43)s比(197.43±69.78)s,(67.79±32.54)s比(176.63±61.06)s,P值均＜0.05],但B、C两组小鼠觅食时间均长于A组[A组造模后第7、14、21、28天觅食时间分别为(27.13±5.36)s、(25.83±7.28)s、(23.13±2.72)s、(26.63±7.60)s,P值均＜0.05].造模后第28天,B及C组小鼠OMP阳性细胞数较A组减少,差异有统计学意义[(108.00±28.19)个/高倍视野比(288.22±84.06)个/高倍视野,(199.33±58.55)个/高倍视野比(288.22±84.06)个/高倍视野,P值均＜0.05].而C组小鼠嗅黏膜OMP的阳性细胞数高于B组(p＜0.05).OMP阳性细胞数量与觅食时间呈负相关关系(r=-0.886,P＜0.01).嗅上皮厚度方面,B组小鼠嗅上皮厚度较A组及C组变薄,差异有统计学意义[(59.57±31.27)tμm比(114.55±40.70)μm比(90.54±37.72)μm,P值均＜0.05].结论 嗅觉训练可促进恢复3-MI诱导的嗅觉障碍小鼠的嗅觉功能.

目的 采用生物信息学方法预测和分析布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的理化性质、信号肽、蛋白结构和抗原表位,为布鲁斯病基因疫苗的研制提供理论基础. 方法 从GenBank中获取Omp31的氨基酸序列,运用在线软件Protparam分析Omp31的理化性质;采用SOPMA软件预测和分析布鲁氏菌外膜蛋白Omp31的二级结构. 结果 利用在线软件预测布鲁氏菌外膜蛋白Omp31分子式为C1135H1725N297O354S4,脂溶性指数为87.31,蛋白质的疏水值为63.26,理论pI值为8.61,原子总数为47 900;其氨基酸序列Gly(G)占12.9％,Ala(A)占11.7％.正电荷残基(Arg+ Lys)、负电荷残基(Asp+ Glu)总数分别为19和24,其不稳定系数48.25.该蛋白为稳定蛋白,亲水性系数GRAVY为-0.091.Omp31无跨膜区域,属于水溶性蛋白,其中无规则卷曲较多,位于蛋白表面.蛋白质中大部分氨基酸可以形成一定的结构域,抗原性总预测值为0.632 4. 结论 生物信息学分析鲁氏菌外膜蛋白Omp31含有多个抗原表位,可能具有免疫原性,表明该蛋白可作为潜在抗原用于疫苗的研制.

目的 研究沙眼衣原体(CT)及不同基因型导致的生殖道感染与输卵管性不孕(TFI)的相关性,并比较不同CT基因型宫颈分泌物中衣原体热休克蛋白60(cHSP60)表达的差异.方法 采用前瞻性队列研究2018年1月～2019年6月梅州城区三家医院收集的254例TFI和635例其他原因不孕患者资料和宫颈分泌物标本,采用巢式PCR扩增外膜蛋白Omp1基因的VD1-VD3序列并测序分型,酶联免疫吸附法(ELISA)检测不同CT基因型感染者宫颈分泌物中cHSP60表达,分析比较两组患者中CT基因型的分布情况和生殖道中cHSP60表达水平.结果 TFI患者CT的阳性率(14.6％,37/254)显著高于其他原因不孕患者CT阳性率(4.9％,31/635);TFI患者感染最常见的CT基因型为E,F和J型,其他原因不孕患者感染最常见的CT基因型为G和D型,TFI与其他原因不孕患者基因型分布的差异性有统计学意义(χ2=16.958,P=0.031);CT阳性的TFI患者生殖道中cHSP60表达水平(111.5±15.0 ng/L)显著高于CT阳性的其他原因不孕患者(103.5±9.9 ng/L)(t=2.754,P=0.008);CT阳性的TFI患者中,E,F和J基因型感染者生殖道中cHSP60表达水平(116.5±14.9 ng/L)明显高于D,G基因型(101.8±9.8 ng/L)(t=3.984,P<0.001).结论 不同CT基因型感染与TFI可能有关,E,F和J型可能是与TFI最密切的基因型.