目的:构建和筛选鲍曼不动杆菌外膜蛋白OmpW的B细胞和T细胞表位。方法:运用生物信息学软件预测OmpW的小鼠B细胞及T细胞表位并合成相应肽段；构建重组质粒pET28a-ompW并原核表达、纯化获得OmpW蛋白；以OmpW蛋白皮下免疫BALB/c小鼠，2周免疫1次，共3次。第3次免疫后1周，收集小鼠血清、分离小鼠脾细胞培养。分别用OmpW蛋白及不同的T细胞表位肽刺激脾细胞，72 h后收集脾细胞上清。间接ELISA法检测小鼠血清中的特异性IgG抗体水平，双抗夹心ELISA法检测脾细胞上清液中IFN-γ浓度。结果:筛选并构建了5个B细胞表位及4个T细胞表位，B细胞表位分别是OmpW B1、OmpW B2、OmpW B3、OmpW B4、OmpW B5，T细胞表位分别是OmpW T1、OmpW T2、OmpW T3、OmpW T4；间接ELISA法检测结果显示，OmpW B1和OmpW B5能够与OmpW全长蛋白质免疫小鼠的血清发生抗原抗体反应，其 A450值与对照组相比显著升高( P<0.001)；双抗夹心ELISA法结果显示OmpW T4表位刺激的脾细胞上清中的IFN-γ浓度最高，与对照组相比差异有统计学意义( P<0.001)。 结论:成功构建并筛选出OmpW蛋白的两个B细胞表位OmpW B1及OmpW B5和一个T细胞表位OmpW T4。

目的 分析外膜蛋白W(OmpW)在鲍曼不动杆菌临床株中的分布及其可能致病机制.方法 选取碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌31株(耐药组)及敏感株30株(敏感组)作为研究对象.采用Western Blot检测OmpW的表达特征差异;OmpW重组蛋白与Hep-2人喉癌上皮细胞株体外共孵育,检测其对Hep-2细胞增殖能力的影响;采用JC-1染色技术观察OmpW对Hep-2细胞的促凋亡作用,并采用Western Blot检测细胞凋亡相关通路蛋白表达情况.结果 OmpW在耐药株中的表达率(100%,31/31)明显高于敏感株(63.33%,19/30),差异有统计学意义(P<0.05).JC-1,染色法检测中,OmpW与Hep-2细胞作用后,其凋亡细胞明显增多.40 μg和80 μg OmpW作用于细胞,其增殖能力明显减弱,差异有统计学意义(P＜0.05);孵育12h及24h后,80 μg ompW组细胞增殖能力明显减弱(P＜0.05);在OmpW作用下,Hep-2细胞Bcl-2蛋白相对表达量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05),但无明显时间及浓度依赖特征;而DR4、Fas Ligand、IGF 1及Caspase 8蛋白表达量无明显变化.结论 耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌临床株高表达OmpW.OmpW重组蛋白可显著抑制Hep-2细胞增殖并呈浓度依赖性,同时促进Hep-2细胞凋亡,促凋亡机制可能主要通过抑制Bcl-2家族蛋白相关信号通路来实现.

目的 探讨多聚磷酸盐激酶1 (ppk1)基因缺失对尿路致病性大肠埃希菌药物敏感性的影响及其机制.方法 在本团队以往的研究中以尿路致病性大肠埃希菌CFT073为标准野生菌株,并成功构建敲除株△pk1和回补株△pk1-C.分别使用纸片扩散法和微量肉汤法检测CFT073、△pk1和△pk1-C对抗菌药物的敏感性;实时荧光定量PCR法对CFT073和△pk1的耐药性相关基因进行定量分析,对使用β-内酰胺类药物刺激的CFT073和△pk1的耐药性相关基因进行定量分析.结果 与CFT073相比,两种药敏实验结果均显示△pk1对头孢噻肟、哌拉西林、他唑巴坦、氯霉素、呋喃妥因、磺胺甲嗯唑和多黏菌素B的敏感性增强(P＜0.05),而△pk1-C的敏感性无差异;实时荧光定量PCR检测CFT073和△pk1耐药性相关基因结果显示,omp F在△pk1中的表达明显上调,ompC、ompA、mdtA、mdtG、marB、marC和pmrD在△pk1中的表达相对下调,ompW和tolC在两菌株中的表达无差异;分别经哌拉西林和头孢噻肟刺激后,CFT073株ompA、ompW和tolC基因的表达量均升高,△pk1的均无统计学差异.结论 ppk1基因的缺失使尿路致病性大肠埃希菌对某些抗菌药物的耐药性降低,并且ppk1基因可以影响其耐药性相关基因的表达.

鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,Ganatis)是家禽中常见的条件性致病菌,主要引起蛋鸡生殖道疾病,造成产蛋量下降.[目的]为探究RTX样毒素GtxA及外膜蛋白(OmpW)对鸭源鸡杆菌生物学特性和致病力的影响.[方法]本研究采用自然转化法对突变株RZΔompW进一步缺失gtxA构建突变株RZΔompWΔgtxA,通过分析其生长特性、黏附能力、引起细胞凋亡程度及对小鼠致病性等,探究其与生物学特性及致病性可能的关系.[结果]结果显示,RZΔompWΔgtxA能稳定遗传gtxA的缺失;单双基因突变株溶血活性均消失、与RZ株相比菌落形态及生长速率并未出现显著改变;相比RZ、RZΔompW和RZΔgtxA,双基因缺失株RZΔompWΔgtxA在不同时段对鸡原代输卵管上皮细胞的黏附能力显著降低(P＜0.05),诱导鸡输卵管上皮原代细胞发生凋亡的能力明显减弱,对小鼠的致病力显著降低.[结论]GtxA毒素和外膜蛋白OmpW在鸭源鸡杆菌毒力、黏附宿主细胞及诱导其细胞凋亡中起重要作用,且可能存在明显的协同关系.本研究为鸭源鸡杆菌感染机制的阐明奠定基础.

目的 建立一种同时鉴定沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的多重PCR快速检测技术,为水产品中食源性病原菌检测提供新思路.方法 基于沙门氏菌invA基因、单核细胞增生李斯特菌prfA、副溶血性弧菌tlh和霍乱弧菌ompW4靶基因保守序列设计特异性引物,进行单重PCR扩增和敏感性试验;优化多重PCR反应体系中退火温度,进行多重PCR特异性、敏感性和人工添加目的菌污染鱿鱼检测试验;建立多重PCR检测技术.结果 建立优化后的多重PCR对4种目标菌的单一或混合基因组DNA进行特异性扩增,而非目标菌金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌、普通变形杆菌、小肠耶尔森菌、大肠埃希氏菌、克雷伯氏菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌、志贺氏菌、阴沟肠杆菌等其他菌株的基因组DNA均未见任何条带;沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和霍乱弧菌的最低检出限为104 cfu/mL,副溶血性弧菌最低检出限为107 cfu/mL.应用多重PCR对人工添加目标菌和非目标菌的鱿鱼进行检测,其结果可信.结论 本研究建立沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌和霍乱弧菌的多重PCR检测,具有快速、简便、灵敏、准确等优点,可为水产品食源性病原菌检测及其防疫检疫检验部门提供一种高效、准确的检测手段.

目的 了解携带三型分泌系统vcsN2基因的非O1/O139群霍乱弧菌的耐药及致病性特征.方法 对疑似霍乱弧菌感染的腹泻患者粪便进行培养,采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪进行生化鉴定,最后通过提取细菌的16 s rDNA,经测序后进行同源性比对.采用K-B法检测霍乱弧菌的耐药性,PCR法对霍乱弧菌的毒力相关基因进行检测.结果 分离菌在弧菌显色培养基中呈现蓝绿色菌落特征,在血琼脂平板中为伴有溶血的乳白色菌落,氧化酶阳性,镜下见两端钝圆、弯曲的革兰阴性杆菌,生化鉴定为霍乱弧菌.经16 s rDNA测序后进行同源性比对,相似性为99.79％.经血清凝集试验显示为非O1/O139群霍乱弧菌.药敏结果显示,该菌株对大部分抗生素敏感,其中包括复方新诺明、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、氨苄西林、头孢吡肟、头孢曲松、四环素、庆大霉素,对头孢唑林、克林霉素、亚胺培南表现为耐药.毒力检测结果显示除携带有三型分泌系统vcsN 2基因外、还携带rtxC、hlyA、toxR、ompW,而检测的O 1/O 139的rfb、tcpA、ctxA、chx均为阴性.结论 这株临床分离的非O1/O139群霍乱弧菌携带的毒力基因较多,需加强肠道门诊腹泻患者非O1/O139群霍乱弧菌毒力及耐药基因的检测,为霍乱弧菌的防控救治提供一定的参考依据.

目的 调查本地区泛耐药鲍曼不动杆菌(extend-drug resistant Acinetobacter baumannii,XDR-AB)37种耐药基因的携带情况及亲缘性关系,包括2种管家基因以及35种获得性耐药基因.方法 基于K-B纸片法检测菌株对16种抗菌药物的敏感性,采用聚合酶链反应检测耐药基因并通过SPSS软件进行样本聚类分析.结果 54株XDR-AB菌株共检测到18种阳性基因,包括OXA-23(53株)、strB(52株)、CarO和abeM(51株)、ADCs(49株)、adeB、aacC和OXA-51(各48株)、adeA(45株)、SHV(26株)、adeC(14株)、CTX-M-9(6株)、IMP(5株)、qacE和CTX-M-1(4株)、tetA(3株)、gyrA(2株)、OmpW(1株),同源性菌株分布于临床不同科室.结论 本地区XDR-AB耐药基因主要集中在β-内酰胺酶、外排泵、氨基糖苷类耐药基因并存在流行传播趋势,应采取有效控制措施并选择联合药物治疗,防止细菌耐药的进一步增加.

芳香族化合物是一类具有苯环结构的有机物,它们结构稳定,不易分解,并可通过食物链进行生物富集和生物放大,对生态环境及人类健康造成极大危害.细菌具有超强的分解代谢能力,能降解多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)等多种难降解芳香族污染物.吸附和转运是细菌进行芳香族化合物细胞内代谢的前提.虽然芳香族化合物的细菌降解已取得较为显著的研究进展,但吸附和转运机理仍不甚清楚.本文讨论了细菌对芳香族化合物的吸附有积极作用的细胞表面疏水性、生物被膜形成和细菌趋化性等影响因素,总结了 FadL家族、TonB依赖性受体蛋白、OmpW家族等外膜转运系统和主要协同转运蛋白超家族(major facilitator superfamily,MFS)转运体、ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白等内膜转运系统对该类化合物跨膜运输作用,并对跨膜转运机制进行了讨论和阐述,旨在为芳香族污染物的防控和治理提供一定理论参考.