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KIR2DS4基因分型方法建立及新等位基因KIR2DS4 *016的鉴定
编辑人员丨6天前
目的:建立稳定的KIR2DS4基因测序分型法并研究KIR2DS4在中国汉族人群中等位基因多态性。方法:采用PCR序列特异性引物(sequence specific primer,SSP)分析法对222名随机中国汉族个体基因组中的KIR2DS4基因进行阴阳性初筛鉴定,对KIR2DS4阳性的标本采用高保真、长片段PCR测序分型技术(PCR-sequence based typing, PCR,PCR-SBT)对KIR2DS4基因的第4、5外显子的片段进行扩增、测序及分型。结果:建立的PCR-SBT方法成功扩增出KIR2DS4基因的第4、5外显子序列,长度达3.2 kb。探究中国汉族人群中KIR2DS4等位基因型及频率。检出KIR2DS4阳性个体为209个,阳性率为94.1%。测序分型共发现12种基因型和7种等位基因,6种已知的等位基因及其检出频率为:KIR2DS4 *00101/011(180次,81.1%), KIR2DS4 *010(53次,23.9%),KIR2DS4 *004(34次,15.3%), KIR2DS4 *003(15次和6.8%), KIR2DS4 *006(2次,0.9%)以及KIR2DS4 *015(1次,0.5%)。发现并鉴定一个新等位基因KIR2DS4 *016,与其最相近的等位基因KIR2DS4 *010区别在第5外显子,KIR2DS4 *010的第5外显子是22 bp缺失型,而KIR2DS4 *016的第5外显子为完整型。该新等位基因在受检人群中被发现3次,频率为1.4%,并非罕见等位基因,该等位基因序列已向GenBank(登录号:KC414890)及IPD-KIR数据库(提交号:IWS40001804)提交,并获得世界卫生组织HLA系统命名因子委员会的命名。 结论:本文中我们成功建立了KIR2DS4基因4、5外显子测序分型方法,并对其等位基因多态性进行了探究,发现了新的KIR2DS4等位基因型,丰富了中国汉族人群KIR2DS4基因多态性数据。
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编辑人员丨6天前
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山东汉族人群中发现一例罕见的血小板特异性抗原HPA-10bw等位基因
编辑人员丨6天前
目的:探讨山东汉族人群血小板抗原系统10(HPA-10w)的基因多态性,补充本地区血小板供者库数据。方法:应用PCR特异性引物分析法(PCR sequence specific primer)和直接测序方法对山东地区汉族血小板捐献者样本进行HPA-10等位基因分型。结果:在1401例山东汉族机采血小板捐献者中,发现一例罕见的HPA-10w(a+b+)杂合子携带者。HPA-10bw等位基因频率在山东汉族人群中约为0.035%。结论:山东汉族人群中HPA-10bw低频抗原的检出,对诊断和预防新生儿同种免疫血小板减少症(neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura,NAIT)以及输血后紫癜(post-transfusion purpura,PTP)具有临床意义。
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编辑人员丨6天前
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CRISPR/Cas9技术介导Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞系的构建及其三维视网膜类器官培养
编辑人员丨6天前
目的:利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养。方法:对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后,利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测,根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA。经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后,将打靶载体电转H9细胞系,在 hES-ZLM-001基因Exon4和3’-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2,进行药物筛选、阳性克隆富集。设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序,根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆。培养所得1-A07细胞系,通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例,采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况。采用核型分析方法检测细胞核型。应用3D培养技术获得视网膜类器官,于分化后不同时间点行冰冻切片,免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况。 结果:H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致。根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA,最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA。电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆,其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7%,所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确,正常表达干细胞标志物,核型分析结果正常。应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。分化后30 d,出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞,分化后45 d,出现RECOVERIN阳性光感受器细胞,分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞。神经节细胞分布于视网膜类器官深层,水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层,光感受器细胞主要分布于顶层。结论:成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系,该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官。得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致,且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜。该细胞系是一种强大的工具,可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究,并促进致盲疾病治疗方法的开发。
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编辑人员丨6天前
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等位基因特异性PCR检测CYP3A5和MDR-1基因多态性方法的建立及临床应用
编辑人员丨2023/8/6
目的 用等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)检测细胞色素P450酶CYP3A5 (A6986G)和多药耐药基因MDR-1 (C3435T)基因多态性,探讨其与肾移植受者他克莫司(Tac)血药浓度和剂量比的相关性.方法 根据CYP3A5 (A6986G)和MDR-1(C3435T)基因多态性位点分别设计ARMS-PCR引物,分析72例肾移植受者外周血基因组DNA中该2个基因位点的多态性,同时以DNA测序法为金标准进行验证.化学发光微粒子免疫分析法测定肾移植受者血Tac浓度,并比较术后1个月时不同基因型受者之间血Tac浓度、Tac剂量/Tac用量的差异.结果 建立的ARMS-PCR法与DNA测序法检测符合率为100%.72例肾移植受者中,CYP3A5*1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的发生频率分别为18.1%、31.9%和50.0%,MDR-1 C/C、C/T和T/T基因型的发生频率分别为27.8%、58.3%和13.9%.此外,不同CYP3A5基因型肾移植受者的血Tac浓度(P=0.014)和Tac浓度/Tac用量(P=0.019)均存在明显差异,进一步两两比较发现,CYP3A5*3/*3基因型受者血Tac浓度/Tac用量明显高于*1/*1和*1/*3基因型(P均<0.05).结论 成功建立检测CYP3A5和MDR-1基因多态性的ARMS-PCR法,肾移植受者CYP3A5*3基因多态性与Tac的药代动力学明显相关.
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编辑人员丨2023/8/6
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重症脓毒症患者感染真菌与β-防御素-1基因多态性的临床相关性研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 研究β-防御素-1 (DEFBI)基因多态性与重症脓毒症患者感染真菌的临床相关性.方法 回顾性研究2014年5月至2017年5月ICU治疗的脓毒症患者200例,分为真菌感染组80例和未发生真菌感染的对照组120例.应用DNA直接测序、聚合酶联反应双引物等位基因特异性扩增法(PCR-ASA)或Taqman方法检测DEFB1基因-1816A/G、-390A/T、-52A/G、-44C/G、-20A/G等5位点在两组患者中的等位基因和基因型,用遗传分析法计算其单倍型的分布频率,ICU脓毒症患者感染真菌与遗传变异易感性的相关性采用Fisher或x2检验分析,风险度应用(OR)反映该遗传因素及其关联程度.结果 真菌感染组80例和对照组130例患者在年龄、性别构成比上无统计学差异(P>0.05).DEFBI基因-1816A/G、-390A/T、-52A/G、-44C/G、-20h/G等5位点在两组患者中均遵守Hardy-Weinberg平衡,等位基因平率和基因型分布在对照组与真菌感染组之间差异无统计学意义(P>0.05).5个位点中常见的单倍型在对照组和真菌感染组中无统计学差异(P>0.05).结论 DEFBI基因等5位点与ICU重症脓毒症患者感染真菌无相关性.DEFBI基因遗传变异可能不是重症脓毒症患者感染真菌的重要遗传学位点.
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编辑人员丨2023/8/6
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A3亚型血型的血清学和分子生物学鉴定分析
编辑人员丨2023/8/6
目的 探讨A3亚型血型的血清学和分子生物学特征.方法 采用单克隆抗-A、抗-B、抗-A1血型试剂检测2例ABO正反定型不符先证者的红细胞ABO抗原,采用标准A、B、O反定型细胞检测先证者血清中的抗-A和(或)抗-B抗体,采用PCR-序列特异性引物分析法确定基因型,采用基因测序法检测ABO基因第6内含子和第7外显子基因序列,同时采集先证者1妻子、女儿的血液标本进行血清学血型和基因检测.结果 先证者1、2红细胞与抗-A呈混合视野反应,血清与B型红细胞呈4+,PCR-序列特异性引物分析基因型分别为A307/O02和A102/O01,基因测序结果第7号外显子分别为C745T和C467T突变;先证者1妻子、女儿血型分别为A型、O型,基因型分别为A101/O02、O02/O02.结论 A3亚型ABO等位基因存在遗传的多态性.
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编辑人员丨2023/8/6
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熔解曲线分析法用于RHD1227G>A基因分型的实验研究
编辑人员丨2023/8/6
目的 建立用于RHD 1227G>A基因分型的熔解曲线分析法.方法 设计合成RHD 1227G>A等位基因特异性引物和公共引物,并在2条等位基因特异性引物5'端加上不同长度的GC序列.在实时PCR反应后,进行熔解曲线分析,依据PCR产物熔解温度的差异,对RHD 1227G>A基因分型.将建立的熔解曲线分析法与常规的PCR-SSP法比较.对于2种方法检测结果不符的标本,进行RHD基因第9外显子测序,确定该标本为RHD 1227G>A基因型.结果 应用熔解曲线分析法对84例标本进行基因分型,其中RHD 1227A+/G-32例,1227A-/G+ 22例,1227A+/G+6例,1227A-/G-24例.发现2例标本熔解曲线法检测的基因型为1227A+/G-,而PCR-SSP法检测结果为1227A +/G+.经基因测序证实这2例标本结果是1227A+/G-.结论 用于RHD 1227G>A基因分型的熔解曲线法具有操作简单、快速、准确等优点,优于常规的PCR-SSP法.
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编辑人员丨2023/8/6
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白念珠菌环介导等温扩增法的建立及其应用价值
编辑人员丨2023/8/6
目的 建立一种简单快速检测白念珠菌的环介导等温扩增技术(LAMP),并评价其临床价值.方法 采用Primer Explorer5.0软件,针对白念珠菌RPSO基因设计4条引物,对LAMP反应体系和反应条件进行优化,评价检测特异性和检测限;收集123例外阴阴道念珠菌病(VVC)组和42例正常对照组的女性阴道拭子,平行进行真菌培养、LAMP检测、PCR检测、1.79 mol/L KOH镜检,真菌培养作为VVC诊断参考方法;组间检测方法阳性率的比较采用Pearson x2检验,LAMP、PCR、镜检与培养法的一致性采用Kappa检验,P<0.05为差异有统计学意义;应用ROC曲线分析法评价LAMP、PCR在VVC诊断中的价值.结果 LAMP技术的最适反应温度为61℃,且特异性高,与其他常见菌株无交叉反应,检测限为103 copies/μL;VVC组和正常对照组的LAMP、PCR、镜检阳性率差异有统计学意义(LAMP,x2=68.576;PCR,x2=64.918;镜检,x2=50.076,P<0.01).LAMP和PCR与培养法有较好的一致性(к=0.744,0.720),镜检与培养法一致性较差(к=0.533);LAMP对VVC的诊断敏感性为87.62%,特异性为88.33%,阳性预测值为92.93%,阴性预测值为80.30%.LAMP、PCR诊断VVC的ROC曲线下面积分别为0.873、0.888,两者的诊断效能差异无统计学意义(Z=0.849,P=0.395 6),但LAMP检测时间短于1h.结论 建立的检测白念珠菌的LAMP技术快速可靠、敏感性好、特异性高,综合筛查性能优于实验室常规方法,可用于白念珠菌感染的辅助诊断和疗效监控.
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编辑人员丨2023/8/6
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PM2.5通过活化p38K/Egr?1途径介导人支气管上皮细胞Beas?2B中血管内皮生长因子表达上调的分子机制
编辑人员丨2023/8/5
目的 探讨大气细颗粒物(PM2.5)暴露后人肺(支气管)上皮Beas-2B细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达水平升高的调控机制.方法 利用生物信息学软件预测人vegf启动子区的潜在转录因子结合位点.采用不同浓度PM2.5(0,12.5,25,50,100μg/ml)刺激Beas-2B细胞,Western印迹法检测VEGF表达调控相关转录因子及其上游蛋白激酶的表达或活化水平.利用相关的siRNA和化学抑制剂分别抑制各信号蛋白的表达和活化后,利用ELISA、Western印迹、RT-PCR和双荧光素报告基因分析法检测PM2.5诱导VEGF表达水平改变情况.结果 发现人vegf启动子区存在转录因子早期生长应答蛋白1(Egr-1)结合位点.经不同浓度PM2.5刺激Beas-2B细胞后,可检测到Egr-1的显著诱导表达.采用特异性siRNA抑制Egr-1表达后,VEGF的转录和蛋白合成反应显著降低,分泌表达水平显著抑制.Egr-1上游蛋白激酶丝裂原活化蛋白激酶p38(p38K)活化水平随PM2.5剂量升高而增强.其特异性抑制剂SB203580预处理Beas-2B细胞后,p38K活化被抑制,Egr-1诱导表达水平显著降低,同时VEGF的转录和蛋白表达均明显受抑.结论 PM2.5可通过诱导Beas-2B细胞中p38K活化引发转录因子Egr-1表达进而上调VEGF的分泌表达水平.
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编辑人员丨2023/8/5
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肝细胞癌手术前后肠道菌群变化与术后肝功能的关系
编辑人员丨2023/8/5
目的 探讨肝细胞癌(HCC)手术前后肠道菌群变化与术后肝功能的关系.方法 采用实时荧光定量PCR法对72例HCC患者手术前后的肠道菌群进行检测.双歧杆菌/肠杆菌(B/E)<1表示肠道菌群失调,采用生化分析法检测肝功能,包括总胆红素、直接胆红素、谷草转氨酶、谷丙转氨酶.结果 PCR扩增结果显示,扩增产物的融解曲线均呈单峰,引物具有高度特异性,构建的标准曲线均达到定量标准.HCC术前双歧杆菌的相对丰度低于肠杆菌(P=0.000),菌群失调发生率为81.9%(59/72).与术前相比,术后双歧杆菌的相对丰度降低(P=0.020),肠杆菌的相对丰度升高(P=0.011),B/E进一步降低(P=0.001);菌群失调发生率升高,但差异无统计学意义(P=0.092).相关分析显示,术后双歧杆菌与术后第3、5天的谷丙转氨酶呈负相关(r分别为-0.234、-0.264,P分别为0.048、0.025).结论 HCC术前存在菌群失调,表现为主要有益菌双歧杆菌减少和主要条件致病菌肠杆菌增加,术后菌群失调进一步加重;术后双歧杆菌的变化与肝功能有关.
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编辑人员丨2023/8/5
