目的:研究乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）对HepG2细胞ZO1表达水平的影响及闭锁小带蛋白1（ZO-1）对肝癌细胞迁移和侵袭的作用。方法:分别转染HBV全基因质粒（pcDNA3.1-HBV1.1或pcDNA3.1-HBV1.3）、空载质粒（pcDNA3.1）和HBV编码蛋白质粒（pHBc、pHBs、pHBp、pHBx）至肝癌细胞，蛋白质印迹法（Western blot）和RT-PCR检测细胞中ZO1蛋白水平及mRNA水平；转染pHBx,免疫共沉淀和Western blot检测ZO1泛素化水平，Transwell小室检测细胞的迁移与侵袭。转染靶向ZO1的siRNA，乳酸脱氢酶实验检测细胞的增殖，流式细胞术检测细胞的凋亡及周期，Transwell小室检测细胞的迁移与侵袭。两组数据间比较用独立样本 t检验，多组数据比较用单因素方差分析。 结果:瞬时转染pHBV1.1和pHBV1.3后，相较于空载体对照，HepG2细胞中ZO1的蛋白水平分别下降了42.99%±6.8%和55.0%5±4.56%，其mRNA水平无显著变化；Huh7细胞中ZO1的蛋白水平分别下降了17.46%±4.94%和47.53%±3.38%。转染pHBx后，ZO1蛋白水平下降了47.02%±3.4%，而转染pHBc、pHBs和pHBp后ZO1蛋白水平比较，差异无统计学意义。转染pHBx未影响ZO1的mRNA水平。转染pHBx导致HepG2细胞中ZO1泛素化水平显著增加，细胞迁移和侵袭能力增强。转染靶向ZO1的siRNA后HepG2细胞的增殖、凋亡和周期无明显变化，而迁移和侵袭能力显著升高。结论:HBx可通过促进ZO1蛋白的泛素化降解，增加肝癌细胞的迁移与侵袭。

以弹性填料和流化床填料为硝化反应的生物挂膜材料,聚羟基丁酸/戊酸共聚酯(PHBV)为反硝化反应的碳源和生物膜载体,通过微生物自然挂膜处理低C/N比水产养殖废水,去除水体中的氨氮、亚硝酸盐氮及总氮.应用Miseq高通量测序技术对生物膜的微生物群落组成和结构进行分析.结果表明:温度25-30℃,该处理系统首次挂膜成功需要4周,启动后运行稳定,对2种不同来源和氮污染程度的养殖废水均有较好的脱氮效果,氨氮、亚硝酸盐氮及总氮的去除率均在90％以上.硝化生物膜(a)的优势菌分别归属变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes).反硝化生物膜(b)微生物群落的多样性指数和丰度指数均远大于前者,主要为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门(Spirochaetae)及绿菌门(Chlorobi).其中,归属于变形菌门p-变形菌纲(Betaproteobacteria)的丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和红环菌科(Rhodocyclaceae)在2种生物膜中占比均较高.由于所处环境(载体,碳源、溶氧等)不同,在属分类水平上,2种生物膜的细菌群落结构表现出明显差异.生物膜a中属的种类仅为b的三分之二,相对丰度＞0.5％的优势菌属,a为8个,b为18个.其中,隶属丛毛单胞菌科和红环菌科未知属的优势种群分别占到a、b总序列数的56.67％和45.51％.磁螺菌属(Magnetospirillum)和硝化螺菌属(Nitrospira)是a中特有的优势功能菌群,梭菌属( Clostridium)、动胶菌属(Zoogloea)、管道杆菌属(Cloacibacterium)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等具有反硝化功能的菌群为b的优势菌属.

目的 探讨微小RNA-548ah(miRNA-548ah)调控组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)对乙型肝炎病毒(hepati-tis B virus,HBV)复制和表达的影响及其在肝组织中的表达与相关性.方法 选择2015年-2017年泰州市人民医院诊治的慢性HBV感染患者18例为研究对象,其中慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者9例,乙型肝炎肝硬化(LC)患者9例,荧光定量PCR检测三种不同肝癌细胞株及CHB患者肝组织中miRNA-548ah和HDAC4分子的表达,应用miRNA-548ah模拟剂和抑制剂转染Huh7细胞、HepG2细胞和HepG2,2,15细胞,检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的表达水平;Pearson相关分析CHB患者肝组织中miRNA548ah和HDAC4表达与临床指标的相关性.结果 miRNA-548ah和HDAC4在Huh7细胞、HepG2细胞和HepG2,2,15细胞的表达差异具有统计学意义(P<00.01);转染pHBV13.质粒的HepG2细胞、Huh7细胞、HepG2,2,15细胞中,与对照组比较,miRNA-548ah模拟剂组HBsAg、HBeAg和HBV DNA的表达均升高,miRNA-548ah抑制剂组HBsAg、HBeAg和HBV DNA表达均降低(P<00.01);CHB患者肝组织中miRNA548ah的表达为(09.0±05.6),低于乙肝LC患者的表达(16.2±07.1)(P<00.5);CHB患者肝组织中miRNA548ah和HDAC4的表达呈负相关(r=-07.46,P=00.21),肝组织中HDAC4的表达水平与血清ALT的水平呈正相关(r=07.33,P=00.25).结论 miRNA-548ah可通过靶向HDAC4调控乙型肝炎病毒的复制与表达,并且影响CHB的病情进展.

目的 观察复制型HBV重组腺病毒Ad-HBV4.1在人肝癌细胞株HepG2中的复制情况及在BalB/C小鼠肝细胞内的表达情况.方法 用HBV4.1片段与重组腺病毒同源重组构建Ad-HBV4.1,测算Ad-HBV4.1的感染复数(MOI).取MOI为100的Ad-HBV4.1感染HepG2细胞,采用免疫组化法检测Ad-HBV4.1感染的HepG2细胞HBsAg、HBcAg,采用Southern吸印杂交法检测细胞HBV DNA复制中间体HBV DNA复制中间体.取BalB/C小鼠30,分为5组,每组6只.一组1 mL的Ad-HBV4.1(约108 efu/mL)尾静脉普通注射,二组1 mL的Ad-HBV4.1腹腔注射.三组10μg的pHBV4.1片段用1.8 mL生理盐水稀释后,尾静脉高压5～8 s内完成注射.四、五组分别生理盐水1.8 mL尾静脉、腹腔注射.注射第3 d处死三组小鼠,注射第1、3、5 d处死其余各组小鼠,取出肝组织,采用免疫组化法检测各组小鼠肝组织HBcAg.结果 Ad-HBV4.1感染的HepG2胞质中存在HBcAg表达,阳性率达90％以上,HepG2细胞胞质中未见HBcAg表达.转染72 h时,HepG2细胞中未能检测到HBV DNA复制中间体;Ad-HBV4.1感染的HepG2细胞中存在HBV DNA复制中间体.第1、3 d时一组小鼠肝组织中未见HBcAg,第5 d小鼠肝组织中可见HBcAg;第3 d三组肝组织中可见HBcAg;各时段二、三、四组小鼠肝组织均未见HBcAg表达.结论 Ad-HBV4.1感染HepG2细胞成功建立HBV复制与表达的体外模型,感染效率达90％以上,可见HBsAg、HBcAg及HBV DNA复制中间体表达.Ad-HBV4.1尾静脉注射BalB/C小鼠肝组织存在HBV表达.

目的:探讨人脐带Wharton's Jelly来源间充质干细胞(hUCWJMSCs)和人牙周膜干细胞(hPDLSCs)复合聚(3-羟基丁酸酯-3-羟基己酸酯)(PHBHHx)、聚羟基丁酸-羟基戊酸酯(PHBV)支架成骨分化的能力.方法:将2种干细胞分别接种在2种支架中,MTT法及粘附率分析2种干细胞和PHBHHx、PHBV的生物相容性;成骨诱导后ALP活性检测、茜素红染色和扫描电镜观察研究两种干细胞在两种支架上的成骨分化情况.结果:2种干细胞与PHBV具有更好的黏附效果及增殖效率(P<0.05),且hUCWJMSCs组优于hPDLSCs组;hUCWJMSCs和hPDLSCs与PHBV组ALP活性检测、茜素红染色阳性表达明显高于与PHBHHx组;hUCWJMSCs与2种支架组的表达高于hPDLSCs组.扫描电镜显示2种干细胞与PHBV组可见大量矿化基质形成.结论:hUCWJMSCs与PHBV生物相容性和成骨能力优于hPDLSCs组.

目的 通过检测不同乙型肝炎病毒(HBV)载量受试者血脂水平的差异及其与HBV的关系及其意义.方法 选择2017年6月至2018年1月住院的100例HBV携带者及同期入院体检的100例健康人作为研究对象,对其健康状态进行复检,确定受试者无其他疾病影响的条件下,将受试者根据HBV载量分为三组:病毒载量≤500拷贝/ml(正常组,n=100),500拷贝/ml＜病毒载量＜1 ×105拷贝/ml(HBV携带组,n=37),病毒载量≥1×105拷贝/ml(乙肝患者组,n=63).检测血清血脂指标[甘油三脂(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、载脂蛋白(Apo)A1]水平和血浆ApoB水平;对转染与未转染pHBV1.3质粒的两种HepG2细胞中AopBmRNA的表达进行测定;对转染与未转染ApoB的两种HepG3细胞中HBsAg、HBeAg含量及HBV-DNA含量进行测定.结果 HBV数量随着患者病情加重而增多,正常者体内不含HBV.血清学检测显示,随受试者体内病毒载量(正常组→HBV携带组→乙肝患者组)的递增,其血清TC、HDL、LDL、AopA1和血浆ApoB水平均呈递降(P均＜0.05);其中,LDL含量下降最为明显.进一步对作为HDL主要载脂蛋白的ApoB进行的RT-PCR检测显示,转染pHBV1.3质粒的HepG2细胞其ApoB mRNA表达水平低于未转染细胞.HBV指标检测显示,未转染ApoB的HepG3细胞其HBsAg、HBeAg和HBV-DNA含量均明显高于转染细胞(P均＜0.01).结论 HBV感染可减少患者血脂水平,并以LDL及其主要载脂蛋白ApoB的下降最明显,HBV感染可降低ApoB对HBV复制的抑制作用,促进HBV的复制.该作用是否通过微粒体TC转移蛋白(MTP)途径而产生,有待进一步研究.

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs)是微生物体内合成的一种天然的高分子生物材料,在碳源过量氮磷等其他营养条件不足的情况下可以作为微生物碳源的储备物质.国PHA同时具有良好的生物相容性、生物可降解性和热加工性能等特性逐渐成为传统石化塑料的最佳替代品.随着PHA产业化发展的不断推进,先后有四代商业化生产的PHA产品(PHB、PHBV、PHBHHx和P3HB4HB)被应用于医药、工业、农业及化工等领域,成为生物材料领域最为活跃的研究热点之一.但因其发酵底物和灭菌成本过高、生产效率和产品性能较低的问题始终没有得到有效解决,很难对石油基塑料保持较大的竞争力,使得探索出低成本合成PHA的方法尤为重要.介绍了目前PHA的主要种类及其特性、开始步入产业化的热门领域,综述了近年来在低成本合成PHA研发中,世界各国科研人员采用的构建低成本代谢途径、改造生产菌株、使用廉价发酵底物及改进发酵流程等策略的研究进展,旨为PHA早日低成本规模化代替石化塑料奠定理论基础.

目的:研究灵猫方对pHBV1.3转染HepG2细胞的天然免疫功能的影响,探讨灵猫方抗乙肝病毒(HBV)的作用机制.方法:制备0.25mg/ml和0.5mg/ml灵猫方水提物干预HBV质粒转染HepG2细胞,以0.9％ NaC1溶液作为空白对照组,72h后收集培养上清液,ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平;收集细胞提取总RNA,RT-PCR法检测细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-λ1及干扰素效应蛋白OAS1、MxA、PRKmRNA表达水平,RIG-Ⅰ mRNA表达水平.结果:与空白对照组比较,0.5mg/ml灵猫方干预pHBV1.3转染HepG2细胞分泌的HBsAg和HBeAg水平明显降低,细胞内IFN-α、IFN-β、IFN-λ1 mRNA及OAS1、MxA、PRKmRNA表达水平表明显升高(P＜0.01),RIG-Ⅰ mRNA表达水平明显升高(P＜0.01).结论:灵猫方通过促进pHBV1.3质粒转染HepG2细胞的Ⅰ、Ⅲ型干扰素产生,增强天然免疫功能,从而抑制HBV复制,可能是通过RIG-Ⅰ通路诱导干扰素产生,增加干扰素的形成.

目的 探讨Na+/K+ ATPase β1亚基(ATP1B1)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制的影响及其作用机制.方法 将稳定表达HBV的质粒pHBV1.3分别与质粒VR1012-ATP1B1及siRNA ATP1B1序列共转染HepG2细胞,EUSA法检测细胞培养上清中HBsAg的含量,qRT-PCR法检测细胞中HBV DNA及RNA含量.Western blot法检测过表达ATP1B1的HepG2细胞中维甲酸诱导基因蛋白-Ⅰ (retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)和黑色素瘤分化相关抗原5(melanoma differentiation-associated 5,MDA5)蛋白的表达,qRT-PCR法检测细胞因子(IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-28a、IL-29)及IFN诱导基因(interferon-stimulated gene,ISG)mRNA含量,以转染载体VR012为对照.结果 过表达ATP1B1可显著降低HepG2细胞培养上清中HBsAg及HBV DNA、RNA含量(P＜0.01);沉默ATP1B1可显著升高HepG2细胞培养上清中HBsAg及HBV DNA、RNA含量(P＜0.01).与VR012组比较,过表达ATP1B1的HepG2细胞中RIG-Ⅰ和MDA5蛋白表达升高;IFNα、IFNβ和IL-29 mRNA含量明显升高(P＜0.05),IFNγ和IL-28A mRNA含量差异无统计学意义(P＞0.05):ISG15、ISG56、OAS2和BST-2 mRNA含量显著升高(P＜0.01),GBP-1 mRNA含量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 ATP1B1可抑制HBV的复制,可能是通过上调细胞内RIG-Ⅰ及MDA5蛋白,诱导Ⅰ型IFN表达,激活下游抗病毒因子ISG发挥作用.

目的:探讨YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白1(YTHDF1)对乙型肝炎病毒(HBV)蛋白表达和抗原分泌的影响.方法:分别以pCD3/Flag-KBE和pSilencer2.1-U6 neo为载体,构建过表达和敲降YTHDF1质粒.在Huh7细胞中过表达HBV蛋白质粒的同时表达pshR-YTHDF1和对照质粒,通过Western印迹检测YTHDF1对HBV蛋白表达的影响.在HepG2.2.15细胞中过表达和敲降YTHDF1,在Huh7细胞中同时过表达pHBV1.3质粒,通过ELISA检测YTHDF1对HBsAg、HBeAg抗原分泌的影响.结果:与正常肝细胞相比,YTHDF1在肝癌细胞Huh7(t=17.4)、HepG2.2.15细胞中(t=39.6)高表达.成功构建过表达和敲降YTHDF1质粒并验证其有效.敲降YTHDF1抑制HBV基因组编码的HBc蛋白(t=9.5)、HBs蛋白(t=5.2)、preS1蛋白(t=25.7)、preS2蛋白(t=9.0)、HBx蛋白(t=19.7)、HBV DNA Pol蛋白(t=23.0)表达,差异均有统计学意义(均P＜0.05).过表达YTHDF1促进-HBsAg(Huh7细胞 t48 h=5.5,t72 h=5.0;Hep G2.2.15细胞 t48 h=5.3,t72 h=27.4)、HBeAg 抗原(Huh7细胞t48 h=5.7,t72 h=6.3;HepG2.2.15细胞t48 h=29.0,t72h=6.6)的分泌,而敲降YTHDF1 抑制 HBsAg(Huh7细胞 t48 h=16.0,t72 h=7.9;HepG2.2.15细胞 t48h=22.3,t72h=7.0)、HBeAg 抗原(Huh7细胞t48h=9.0,t72h=14.3;HepG2.2.15细胞t48h=8.1,t72h=6.6)的分泌(均 P＜0.05).结论:YTHDF1可能具有增加HBV蛋白表达及促进HBsAg和HBeAg抗原分泌的作用.