目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均 P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均 P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均 P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均 P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（ F值分别为8.168、4.644、1.981，均 P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（ F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均 P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均 P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均 P > 0.05）。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

目的 了解中国人群化脓性汗腺炎(HS)临床特征以及遗传学发病机制.方法 收集52例HS患者(其中1例有家族史),对其临床特征进行分析,并收集每位患者的外周血标本,采用Sanger直接测序的方法,在每位患者中对NCSTN、PSENEN和PSEN1基因进行突变检测.结果 ①经典型(腋窝-乳房型)HS为23例、聚合型HS为18例、摩擦疖肿型HS为5例、瘢痕-毛囊炎型HS为6例;②51例散发HS和1例具有家族史的HS中未发现NCSTN、PSENEN和PSEN1基因突变位点.结论 52例HS患者的临床类型以经典型和聚合型为主;家族性和散发性HS发病可能具有一定的遗传异质性.

目的 通过SwissTarget及PubMed数据库预测人参皂苷Rg1治疗高糖损伤大鼠视神经细胞的潜在靶点及作用机制.方法 利用PubMed compound网站获取人参皂苷Rg1的分子结构式并于SwissTarget数据库进行Rg1治疗全部疾病的靶点预测,通过高糖损伤视神经相关PubMed数据库数据集GSE 27382分析视神经损伤患者与健康人员差异基因的表达情况,将SwissTarget数据库的预测结果与PubMed数据库分析结果进行集合,最终筛选Rg1治疗高糖损伤大鼠视神经细胞的潜在靶点IL-2、PTAFR、PSEN2、PSENEN、NCSTN、APH1A、PSEN1、APH1 B、HSP90AA1,将获得的靶点进行KEGG及GO富集分析,明确相关的生物过程及分子功能、信号通路,将Notch/MAPK信号通路选定为机制研究的内容.镜下摘取饲养的16只Wist-ar大鼠双侧视神经,使用含新生胎牛血清的DMEM/F12培养基进行原代培养2周,经过形态学验证后,将细胞分为对照组、高糖损伤组(高糖DMEM/F12培养24 h)、Rg1治疗组(10μg·L-1 Rg1及高糖DMEM/F12同时培养24 h)及Notch1抑制剂组(10μg·L-1 Tangerintin及高糖DMEM/F12同时培养24 h).采用CCK-8法检测不同组别大鼠视神经细胞培养24 h、48 h、72 h的增殖能力,采用免疫印迹法验证Notch/MAPK信号通路蛋白表达的变化.结果 细胞增殖实验结果显示,与对照组相比,高糖损伤组大鼠视神经细胞培养24 h、48 h、72 h后吸光度均明显下降(均为P<0.05);与高糖损伤组相比,Rg1治疗组大鼠视神经细胞培养24 h、48 h、72 h后吸光度均增加(均为P<0.05).免疫印记法结果显示,与对照组相比,高糖损伤组大鼠视神经细胞Notch1受体蛋白表达下降,MAPK、JNK、ERK1、P38蛋白表达均增加;而与高糖损伤组相比,Rg1治疗组和Notch1抑制剂组大鼠视神经细胞中Notch1受体蛋白表达均升高,MAPK、ERK1、JNK、P38蛋白表达均下降.结论 人参皂苷Rg1通过激活Notch1受体影响Notch/MAPK信号通路,进而缓解高糖引起的大鼠视神经损伤.

目的 利用CRISPR/Cas9敲除文库在人正常肺上皮细胞致瘤性转化过程中进行全基因组筛选,以发现新的人肺癌抑癌基因,并利用临床非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)样本数据库进行初步验证.方法 构建稳定表达Cas9蛋白的人正常肺上皮BEAS-2B细胞系,在该细胞中感染含有77 441个单链向导RNA(sgRNA)、靶向19 114个人类基因的Brunello慢病毒文库,于裸鼠皮下移植.提取全瘤体细胞(Tumor)及移植前细胞(Input)的全基因组DNA,扩增sgRNA序列,建库进行深度测序.通过分析Tumor中sgRNA读数占比及Tumor与Input中sgRNA读数差异倍数的改变,筛选功能缺失后诱导BEAS-2B细胞致瘤性转化的抑癌基因,并利用公共数据平台进行初步验证.结果 成功在稳定表达Cas9蛋白的BEAS-2B细胞中进行了文库感染及裸鼠皮下成瘤实验.只有感染文库的细胞在部分接种位点成瘤.测序结果显示Tumor中只检测到少数sgRNA,选取sgRNA的读数占总读数的比例＞1％或有2个及以上sgRNA被显著富集的38个基因为有效的人肺癌候选抑癌基因,包括NF2、PTEN等已知抑癌基因及未在肺癌中报道过的候选抑癌基因,如AP2M1、PSENEN等.富集分析发现候选抑癌基因在Notch和Hippo信号等参与癌症发生的关键生物学通路中富集.应用临床NSCLC样本数据库证实38个候选抑癌基因在NSCLC样本中均发生了突变,其中突变率＞2％的17个基因中有14个与KRAS或TP53发生共突变,3个突变与预后相关;30个基因在NSCLC样本中的表达水平与正常癌旁组织有明显差异,17个基因的表达水平与患者的预后密切相关.结论 利用体内全基因组CRISPR/Cas9技术筛选出38个人肺癌候选抑癌基因,并在临床NSCLC样本数据库中得到了初步验证.