目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的 在杆状病毒中表达寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)包膜蛋白(Envelope protein,E蛋白).方法 人工合成ZIKV E基因全长序列(1 518 bp),并克隆到pFastBac1载体上,得到重组杆状病毒转移载体pFB1-E,转化含DH10Bac感受态细胞,获得骨架质粒rBacmid-E,转染sf9细胞,得到重组杆状病毒rBac-E.检测病毒滴度,PCR法检测E基因的插入,间接免疫荧光和Western blot法检测E蛋白的表达.结果 经PCR方法鉴定,重组杆状病毒骨架质粒构建成功,重组病毒rBac-E(第3代)病毒滴度为2.58×105pfu/ml.提取感染rBac-E的sf9细胞基因组,经PCR扩增得到3 830 bp的条带,间接免疫荧光检测出现特异性绿色荧光.Western blot鉴定可见感染重组杆状病毒rBac-E的细胞沉淀中在相对分子质量55×103处有特异性条带.结论 在杆状病毒表达系统中重组表达了ZIKV E蛋白,为ZIKV E蛋白功能研究及疫苗的开发奠定了基础.

目的 利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α). 方法 根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH 10 Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α.采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力. 结果 重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml. 结论 构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础.

目的:构建远程医疗数据实时监控系统,提升医疗隐私数据和远程医疗通信的安全性.方法:设置隔离区(demilitarized zone,DMZ)以隔离内网与外网;通过简单网络管理协议(simple network management protocol,SNMP)对数据流量进行分析,对远程医疗通信过程中的网络服务进行监控;设置虚拟化蜜罐对入侵者的行为进行记录和监测;采用词上下文字符嵌入(word-context character embedding,WCC)模型和基于角色的权限访问控制(role-based access control,RBAC)为不同角色分配不同的访问权限.结果:基于DMZ的远程医疗数据实时监控系统能对远程医疗通信中的异常流量进行监控,对医疗数据进行隐私保护.结论:该系统较好地弥补了传统网络流量监测模型的缺陷,有效地集成了各种安全机制,保障了系统的高效性与安全性.

为了检测中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)抗体水平,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建含有CSBV VP2的重组杆状病毒rBac-VP2,并在昆虫细胞中获得表达.用经过纯化的重组VP2蛋白作为包被抗原,建立CSBV抗体的间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法.结果 表明成功的表达了VP2蛋白.优化反应条件后,建立的ELISA检测方法仅与CSBV阳性IgY发生特异性反应,与其它蜜蜂病毒的阳性IgY不发生交叉反应,且检测阳性IgY的灵敏度达到了1∶6400,证明其具有良好的特异性和敏感性.批内重复与批间重复变异系数均小于10％.与CSBV全病毒包被进行比较,检测结果差异不显著,说明该方法适用于抗CSBV抗体检测.

以“健康苏州掌上行”项目为例,通过借鉴基于角色的访问控制(RBAC)模型,设计完成“家庭圈”模型,并将“家庭圈”模型应用在“互联网+医疗健康”便民惠民具体实践中,使老人与儿童等人群,也能享受到“互联网+”带来的便利.同时,进一步探讨了该模型未来在医疗健康领域的其他应用.

为保障医学影像数据在共享过程的安全访问和有序使用,系统安全服务成为关键.提出了一种支持请求-授权的RBAC扩展模型,并以此扩展模型为指导思想提出了一种新的访问控制系统方案,初步应用到影像共享系统中.该RBAC扩展模型的优点在于不仅较好地实现了本地数据库的安全访问,而且其请求授权功能为共享系统的域间访问奠定了基础.

手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)是一种常见传染病,以婴幼儿发病为主,柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CV-A6)是引起HFMD暴发的主要病原体,其疫苗开发有待深入的研究,而病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)是潜在安全的候选疫苗.为制备CV-A6 VLPs,并研究其免疫原性,本研究利用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统共表达P1和3CD蛋白,制备并纯化CV-A6 VLPs,应用间接免疫荧光试验(Indirect immunofluscent assay,IFA)、SDS-PAGE、Western Blot、透射电镜法等方法鉴定.以Al(OH)3为佐剂,三种不同剂量CV-A6 VLPs免疫BALB/c小鼠,采用微量中和试验法检测小鼠血清中和抗体滴度.结果显示,重组有P1和3CD的杆状病毒质粒转染Sf9细胞,可形成CV-A6类病毒颗粒,直径约为26nm.SDS-PAGE和Western Blot结果说明P1前体蛋白被3CD作用切割产生了VPO、VP1和VP3,CV-A6VLPs由这三个病毒结构蛋白构成.小鼠免疫实验结果显示,CV-A6 VLPs可以刺激产生较高水平抗CV-A6的特异性中和抗体,维持至少12周,并且抗体中和效价与免疫剂量和免疫次数呈正相关.本研究获得重组杆状病毒rBac-CV-A6-P1-3CD,并在Sf9细胞内成功表达CV-A6 VLPs,可以刺激小鼠产生较高水平和持久的体液免疫反应.

目的 通过昆虫杆状病毒表达系统获得具有良好免疫原性的流感病毒蛋白.方法 将Hemagglutinin[In-fluenza A virus(A/California/09/2009(H1N1))进行截短,取57-271球状头部结构域氨基酸序列,在前面加Igκ leader信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD),设计H1HAHead基因.将基因序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优化、合成,通过EcoRI和HindⅢ双酶切克隆至pFastBAC HTA载体上,获得含有目的基因的重组质粒pFastBAC HTA-H1HAHead.利用热激法将重组质粒转化至大肠埃希菌DH10 BacTM感受态细胞,蓝白斑筛选获得重组杆状质粒rBac-mid-H1HAHead.在脂质体的介导下,将重组杆状质粒转染至SF9细胞,对病毒进行拯救,转染后120 h,收取上清病毒液,盲传3代,获得SF9细胞,运用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测目的蛋白的表达.结果 经双酶切鉴定成功插入长度为762 bp的目的基因H1HAHead,通过脂质体介导长度为3 192 bp的重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead构建成功.杆状病毒系统可表达目的蛋白,其分子质量单位28.25 ku,与预期一致.Western blot鉴定该蛋白能与特异性标签His-tag发生反应,IFA鉴定感染重组病毒的SF9细胞外源蛋白表达.结论 通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达目的蛋白,该蛋白有反应性,为流感抗体检测和新型疫苗的开发奠定了基础.

目的 制备柯萨奇病毒A2(Coxsackievirus A2,CV-A2)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),并对其进行纯化及鉴定.方法 将CV-A2 P1和3CD)基因序列根据昆虫细胞偏好特性进行密码子优化并人工合成,分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(pPh)和pPIO启动子后,构建重组质粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD,转化至大肠埃希菌(E.coli)DH10 BacTM中,转座形成重组bacmid,再将重组-bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-CV-A2 P1-3CD),经蔗糖垫底离心和氯化铯密度梯度离心法纯化rCV-A2 VLPs,SDS-PAGE、Western blot法检测浓度及纯度,透射电镜法观察VLPs颗粒形态.结果 质粒pFastBacDualCV-A2 P1-3CD经双酶切鉴定,重组Bacmid、rCV-A2 VLPs经PCR鉴定,均在预期目标条带处可见清晰条带;rCV-A2 P1-3CD蛋白经IFA鉴定可见明显荧光;rCV-A2 VLPs经SDS-PAGE及Western blot分析,均可见清晰的VPO(相对分子质量约39 000)、VP1(相对分子质量约34 000)和VP3(相对分子质量约27 000)条带;透射电镜观察纯化rCV-A2 VLPs,可见直径23-33 nmr的颗粒,形态和大小与CV-A2一致.结论 成功构建了 pFastBacDualCV-A2Pl-3CD重组Bacmid质粒,并成功表达了 rCV-A2 VLPs,为今后rCV-A2 VLPs疫苗的研发奠定了基础.