昆虫杆状病毒表达载体系统是基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立的真核表达体系，具有安全性高、重组蛋白表达水平高、能同时表达多个基因，可对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰等优势，主要应用于预防性及治疗性疫苗和基因治疗药物的研发及生产。本文对该载体系统的关键技术及应用进展作一综述。

目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:筛选表达量高且具有血凝抑制活性的B/Yamagata系流感病毒血凝素(HA)重组蛋白.方法:以B/Singapore/IN-FTT-16-0610/2016的HA为基础,在HA胞外区C末端分别融合GCN4pLL三聚化基序、GCN4pLL-半胱氨酸及GCN4pLL-七鳃鳗可变淋巴细胞受体-B(VLR-B)抗体C端的肽段序列,分别获得HA突变体基因BY-T、BY-LLc及BY-PLc;分别插入pFast-Bac1,采用杆状病毒昆虫细胞表达系统进行表达.表达鉴定后,Strep-Tactin亲和层析纯化,然后鉴定纯化突变体蛋白的寡聚程度及血凝活性.突变体蛋白免疫小鼠,检测免疫血清HA特异性IgG抗体和血凝抑制(HAI)抗体水平.结果:各HA突变体均能够有效表达,BY-T突变体表达水平最高,易于纯化,纯度好,呈多聚化形式存在;BY-LLc及BY-PLc表达水平次之,呈高聚化形式存在.三种HA突变体蛋白的血凝活性相当,均可有效诱发的HA特异性结合的IgG抗体和HAI抗体.结论:HA蛋白胞外区C端融合寡聚化基序GCN4pLL的突变体易于纯化,具有血凝活性,可诱发小鼠产生HA特异性抗体和HAI抗体.研究为B/Yamagata系流感病毒重组蛋白疫苗的研发策略提供了参考.

目的:探究重组磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor，PLA2R）串联显性表位（PLA2RTD）在去除原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy，PMN）抗PLA2R自身抗体（anti-PLA2R）中的作用。方法:在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞体系中表达重组蛋白分子PLA2RTD（富含半胱氨酸结构域、C型凝集素样结构域1和C型凝集素样结构域7），圆二色谱法测定PLA2RTD的二级结构，酶联免疫吸附测定法和免疫荧光法测定PLA2RTD的生物活性，环氧活化法耦联重组PLA2RTD与琼脂糖凝胶CL-6B微球以制备anti-PLA2R的特异性免疫吸附剂。结果:该研究实现了PLA2RTD在杆状病毒穿梭载体-昆虫细胞系统中的首次表达，证明了PLA2RTD具有良好的免疫原性和较高的结合特异性。PLA2RTD免疫吸附剂体外单次吸附可平均消除76.66%的anti-PLA2R［（6.66±0.30）RU/ml比（28.54±2.10）RU/ml］，吸附完成后血浆中IgG、IgA、白蛋白、β2微球蛋白、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的含量变化<4%，第2～3次重复使用时仍可保持65%左右的吸附效率。结论:基于PLA2RTD的特异性免疫吸附剂能够有效地清除血浆中anti-PLA2R，为特异性清除与PMN相关的自身抗体提供了一种新途径。

目的:研究新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针的效果。方法:选择新型冠状病毒受体结合域(receptor binding domain，RBD)进行3次重复拷贝串联作为免疫原(RBD-sc-trimer)，利用昆虫杆状病毒表达系统表达RBD-sc-trimer重组蛋白，并用His-标签亲和纯化。纯化产物进行Western blot鉴定并在体外验证其与人血管紧张素转化酶2(human angiotensin converting enzyme 2, hACE2)的结合能力。在BALB/c小鼠模型中进行免疫原性检测(结合抗体及中和抗体)，同时与RBD二聚体(RBD-Fc)、RBD单体(RBD)和刺突蛋白三聚体(S trimer)进行比较。结果:RBD-sc-trimer的免疫原性优于RBD-Fc和RBD，并能达到S trimer的水平。RBD-sc-trimer能诱导产生较强的Th1偏向型抗体应答，并能交叉中和新型冠状病毒Beta、Delta和Omicron变异株，其中相较于原始毒株，针对Omicron的中和抗体水平仅下降9.1倍，远低于RBD-Fc(68.4倍)和S trimer(70.8倍)组的下降水平。结论:本研究制备的新型冠状病毒重组蛋白疫苗作为加强针可以诱导较强以及更为广谱的体液应答，能更好地应对变异株，具有较好的研发与应用前景。

目的:应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备共表达H7N9 M2蛋白及高致病性禽流感H5N1 HA蛋白的病毒样颗粒（VLPs）。方法:将H7N9亚型禽流感M2蛋白作为基础蛋白，与禽流感H5N1膜蛋白HA共表达，通过杆状病毒表达系统表达出VLPs，纯化后通过蛋白印迹试验鉴定VLPs中蛋白的表达情况，用透射电镜观察VLPs形态，血凝试验测定VLPs的活性。结果:H5N1 HA、H7N9 M2蛋白可以在昆虫细胞中共表达，相对分子质量为76 000，并组装成流感VLPs；电镜观察到VLPs的形态与流感病毒一致，直径70~80 nm；血凝试验显示该VLPs具有类似流感病毒的血凝活性。结论:该方法可以制备流感VLPs，为H7N9与H5N1高致病性禽流感广谱疫苗研究提供了可行方案。

目的:制备GII.3[P12]型人源诺如病毒(human norovirus, HuNoV)广州株GZ2013-L20的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)和多克隆抗体，系统表征其免疫原性特征和受体结合能力，为HuNoV防控提供数据支撑。方法:以GZ2013-L20毒株基因组为模板，扩增ORF2并构建重组转座载体，转化至大肠埃希菌 DH10 Bac获得重组杆状病毒质粒Bacmid-L20-ORF2，在昆虫细胞sf9中表达目的VLP，采用透射电镜、SDS-PAGE、Western blot(WB)和受体结合实验等方法对纯化后VLP进行鉴定。此外，将VLP免疫小鼠获得多克隆抗体，通过间接ELISA和受体结合阻断试验进行评价。 结果:构建了重组杆状病毒Bacmid-L20-ORF2，并成功获得目的毒株VLP；透射电镜显示颗粒直径约为30 nm；SDS-PAGE和WB结果显示蛋白相对分子质量(Mr. ×10 3)约58；受体结合实验表明，目的VLP与分泌型唾液受体(A型、B型、AB型和O型)、O型非分泌型唾液受体以及猪胃黏蛋白均能有效结合；VLP多克隆抗体效价达到2×10 5，且与20种(20/28)基因型HuNoV的衣壳蛋白具有交叉免疫反应；受体结合阻断实验显示，多克隆抗体仅对同型VLP具有中和阻断效果，而对GII.2、GII.4、GII.8和GII.17等基因型VLP没有中和作用。 结论:GII.3[P12]型HuNoV广州株VLP与分泌型和非分泌型唾液受体均呈现较强的结合能力，其多克隆抗体具有免疫结合广谱性，但中和阻断效果仅对同型病毒有效，其结果为疫苗研发的理性设计提供基础数据。

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础.方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1.分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3.通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测.结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2 000 bp的基因片段,与预期大小相符.昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52 000,与预期相符.WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应.结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件.

目的 比较不同信号肽对SARS-CoV-2 S1、受体结合域(receptor binding domain,RBD)、RBD二聚体蛋白在Expisf9昆虫细胞中分泌表达的影响.方法 选取SARS-CoV-2 S1(M1-E661)、RBD(R319-P545)、RBD二聚体(R319-K537串联)3种蛋白的基因序列,按照N-端信号肽序列不同[内源(Endo)、蜂素honeybee melittin(HBM)、GP64、GP67、几丁质酶chitinase(Chi)、HIV-ENV]和C-端标签序列的不同,分为25组.通过Bac-to-Bac系统构建25种重组杆状病毒,建立25组三级毒种库.将B2和C4病毒分别接种至对数生长前期细胞(2.8×106个/mL)和对数生长中期细胞(1.2× 107个/mL).将各组病毒培养至100mL(500mL摇瓶),进行蛋白表达,并取样进行SDS-PAGE、Western blot和ELISA检测.S1、RBD、RBD二聚体蛋白各选择表达量较高的2组,进行重复验证.结果 B2、C4病毒接种至高密度细胞,分泌表达量未提高,接毒后培养4和5 d的分泌表达量存在显著差异.A7(Endo-S1-tag)的分泌表达量明显低于 A9(HIV-ENV-S1-tag),A4(Gp67-S1-tag)分泌表达量最高,A1(Endo-Endo-S1-tag)分泌表达量显著低于 A7(Endo-S1-tag);B6(HIV-ENV-RBD-tag)分泌表达量显著高于 B4(Gp67-RBD-tag)及其他信号肽组;C4(Gp67-RBD-dimer-tag)分泌表达量明显高于C3(Gp64-RBD-dimer-tag).分别选择每种蛋白表达量较高的2组(A4、A9;B4、B6;C3、C4)进行重复验证确定,结果显示,A4、B6、C4的分泌表达量最高.结论 S1、RBD二聚体蛋白分泌表达量最高的信号肽相同,是GP67信号肽,而RBD蛋白的最适信号肽是HIV-ENV信号肽.表明N-端序列会影响蛋白的分泌,信号肽序列有一定的通用性,但也与要表达的目的蛋白序列有关.

目的 研究斯氏按蚊肽聚糖识别蛋白S2(PGRP-S2)的功能及其对按蚊体内共生菌稳态的影响.方法 将羽化后2～4日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)、感染血组(叮咬原虫血症为4％～8％的伯氏疟原虫ANKA感染小鼠)和健康血组(叮咬健康小鼠),每组60只,饱血24 h后分离中肠和其余组织,用Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将羽化后0～1日龄雌性斯氏按蚊分为对照组(喂食10％蔗糖溶液)与抗生素处理组(喂食含有青霉素、链霉素和庆大霉素的10％蔗糖溶液),每组30只,喂养5 d后分离中肠和其余组织,RT-qPCR检测pgrp-s2基因的相对转录水平.将雌性斯氏按蚊分为pgrp-s2敲低组和绿色荧光蛋白基因(gfp)对照组,每组60只,分别注射pgrp-s2的双链RNA(dsRNA)和gfp基因dsRNA(69 nl/只),2 d后每组取蚊虫提取RNA,RT-qPCR检测pgrp-s2的相对转录水平,提取DNA并使用16S rRNA特异性引物PCR检测蚊虫体内共生菌总量.分别取30只pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊,用107个/ml摩氏摩根氏菌液浸湿棉球喂养5 d后,提取RNA,RT-qPCR检测获得共生菌16S rRNA相对总量和摩氏摩根氏菌的相对数量;提取pgrp-s2敲低组和gfp对照组按蚊中肠组织RNA,转录组测序后进行聚类分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能注释和富集分析.使用SMART网站预测分析PGRP-S2氨基酸序列后利用CLC Main Workbench软件进行比对.克隆按蚊pgrp-s2基因,利用昆虫杆状病毒表达系统(pFastbac Ⅰ)在SF9细胞中表达PGRP-S2重组蛋白,Western blotting检测蛋白表达情况.取10、20、40 μg/ml纯化后的PGRP-S2重组蛋白溶液(以蛋白缓冲液为对照)分别与40 μg赖氨酸(Lys)型肽聚糖和二氨基庚氨酸(DAP)型肽聚糖孵育,每间隔12 h测定相对吸光度(A540值)以判定肽聚糖的降解情况,验证PGRP-S2的酰胺酶活性.结果 RT-qPCR结果显示,吸血后24 h,感染血组、健康血组和对照组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平分别为1 590.0±665.2、126.8±100.4和15.84±6.92,感染血组高于对照组(t=2.38,P＜0.05);对照组按蚊中肠的pgrp-s2的相对转录水平高于其余组织(1.71±0.51)(t=2.04,P＜0.05).抗生素处理组按蚊中肠pgrp-s2的相对转录水平为0.33±0.18,低于对照组的117.9±54.5(t=2.16,P＜0.05).pgrp-s2敲低组按蚊体内共生菌16S rRNA相对总量为3 653±2 023,低于gfp对照组的14 982±3 892(t=2.58,P＜0.05);摩氏摩根氏菌饲喂后,pgrp-s2敲低组按蚊体内摩氏摩根氏菌的相对数量为571 517± 61 258,低于gfp对照组的919 754±123 397(t=2.53,P＜0.05).转录组分析结果显示,pgrp-s2敲低可以上调按蚊免疫相关的Toll/Imd通路、mTOR通路、FoxO通路基因,下调脂肪酸代谢、三羧酸循环等代谢相关基因.10、20、40 μg/ml PGRP-S2重组蛋白与DAP型肽聚糖孵育48 h后,相对A540值分别为0.49±0.07、0.40± 0.10和 0.44±0.07,均低于对照的 0.90±0.09(t=3.53、3.65、3.97,均P＜0.05);但与 Lys型肽聚糖孵育 48 h后,相对A540值分别为0.52±0.03、0.62±0.03和0.65±0.04,与对照(0.64±0.05)的差异均无统计学意义(t=1.95、0.31、0.11,均P＞0.05).结论 斯氏按蚊体内pgrp-s2主要在中肠表达,且表达水平受共生菌调控.PGRP-S2重组蛋白可以降解DAP型肽聚糖,具有酰胺酶活性,可通过负调节免疫反应和调节代谢反应调控按蚊体内共生菌水平.