目的:研究卫矛茎皮醇提取物(EAT)和卫矛翅翘醇提取物(EAW)抗四氯化碳诱导小鼠肝纤维化的作用，并初步探讨其可能机制。方法:选取60只C57BL/6小鼠，按随机数字表法随机分成健康对照组、模型组、EAW低剂量组、EAW高剂量组、EAT低剂量组、EAT高剂量组，每组10只。从造模前3 d开始，EAT低、高剂量组和EAW低、高剂量组小鼠分别予EAT和EAW各2.0、8.0 g/kg(含生药量)灌胃，健康对照组和模型组小鼠均给予等体积纯净水灌胃，1次/d，直至开始造模后第30天，共灌胃33次。EAT低、高剂量组和EAW低、高剂量组，以及模型组小鼠均予5%四氯化碳橄榄油溶液8 mL/kg腹腔注射，健康对照组小鼠予等体积0.9%氯化钠溶液腹腔注射，每周注射2次，至开始造模后第30天，共注射9次。检测各组小鼠的肝脏指数和血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素、白细胞介素-6(IL-6)水平。采用苏木精-伊红和Masson染色法观察小鼠肝组织病理学变化并计算胶原容积分数，采用改良组织学炎症活动度(HAI)和Ishak系统评分评估小鼠肝组织的肝脏炎症反应和纤维化程度。采用免疫组织化学染色法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平，蛋白质印迹法检测α-SMA、基质金属蛋白酶2(MMP2)和胞外信号调节激酶(ERK)1/2的蛋白质表达水平，荧光定量聚合酶链反应检测 MMP2、 ERK1/2的mRNA表达水平。统计学方法采用方差分析、Tukey检验、Dunn检验。 结果:EAW低、高剂量组和EAT高剂量组小鼠的肝脏指数均低于模型组(0.06±0.01、0.05±0.01、0.05±0.01比0.07±0.01)，差异均有统计学意义( q＝5.12、7.70、7.11，均 P<0.01)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组小鼠血清ALT、AST水平均低于模型组[(601.76±141.38)、(283.35±42.32)、(734.74±116.06)、(391.60±34.33) U/L比(982.45±96.04) U/L，(509.49±152.29)、(345.41±67.39)、(282.30±65.72)、(243.23±45.20) U/L比(766.01±114.49) U/L]，差异均有统计学意义( qALT ＝9.88、20.81、7.65、17.58， qAST ＝5.11、12.52、14.92、15.56；均 P<0.001)。EAW和EAT高剂量组小鼠血清总胆红素水平低于模型组[(6.81±0.49)、(7.08±1.78) μmol/L比(12.68±3.28) μmol/L]，差异均有统计学意义( q＝6.31、6.01，均 P<0.01)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组小鼠血清IL-6水平均低于模型组[(29.26±5.42)、(24.28±4.75)、(9.05±1.74)、(8.01±1.24) ng/L比(53.21±10.05) ng/L]，EAT低剂量组IL-6水平低于EAW低剂量组，EAT高剂量组IL-6水平低于EAW高剂量组，差异均有统计学意义( q＝12.20、14.73、22.48、22.11、10.28、7.96，均 P<0.001)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组胶原容积分数均低于模型组[(6.15±1.09)、(2.91±0.76)、(7.07±1.37)和(5.31±0.80)分比(12.36±1.96)分]，EAW高剂量组低于EAW低剂量组和EAT低、高剂量组，差异均有统计学意义( q＝11.68、17.78、9.94、13.25，6.10、7.84、4.53；均 P<0.05)。EAW和EAT高剂量组的HAI和Ishak系统评分均低于模型组[6.0分(5.5分，7.5分)、7.0分(6.0分，7.5分)比13.0分(12.0分，13.0分)，1.0分(1.0分，2.0分)、2.0分(1.0分，2.0分)比4.0分(3.0分，4.0分)]，差异均有统计学意义( ZHAI＝3.38、3.23， Zlshak＝3.22、3.03；均 P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示，EAW低剂量组、EAW高剂量组、EAT高剂量组、EAT低剂量组、模型组小鼠肝组织中α-SMA表达水平分别为4.76±0.36、2.75±0.29、3.72±0.34、5.20±0.79、5.98±0.52，蛋白质印迹法检测结果显示，模型组、EAW低剂量组、EAW高剂量组、EAT低剂量组、EAT高剂量组α-SMA蛋白质表达水平分别为0.96±0.11、0.67±0.07、0.22±0.01、0.78±0.08、0.68±0.07，2种检测方法均提示EAW低、高剂量组和EAT高剂量组小鼠肝组织中α-SMA表达水平均低于模型组，EAW高剂量组的α-SMA表达水平均低于EAW低剂量组和EAT低、高剂量组，差异均有统计学意义( q免疫组织化学＝6.06、15.95、11.18、9.92、12.10、4.79， q蛋白质印迹法＝7.29、18.34、6.84、11.05、13.97、11.49，均 P<0.05)。EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组，以及模型组小鼠肝组织中MMP2、ERK1/2的蛋白质和mRNA表达水平分别为0.18±0.04、0.16±0.04、0.28±0.02、0.21±0.02、0.84±0.02，0.80±0.02、0.57±0.08、0.83±0.03、0.69±0.02、0.91±0.04，18.74±1.90、10.73±1.24、24.99±1.84、7.19±0.48、24.68±1.18，29.44±4.47、11.96±0.53、24.75±4.04、5.30±0.36、35.76±0.85，EAW低、高剂量组和EAT低、高剂量组小鼠肝组织中MMP2蛋白质表达水平均低于模型组，EAW、EAT高剂量组小鼠肝组织中ERK1/2蛋白质表达水平均低于模型组，EAW高剂量组ERK1/2蛋白质表达水平低于EAT高剂量组，EAW、EAT高剂量组小鼠肝组织中 MMP2和 ERK1/2的mRNA表达水平均低于模型组，EAW高剂量组的 MMP2和 ERK1/2 mRNA表达水平均低于EAW低剂量组，EAT高剂量组 MMP2和 ERK1/2 mRNA表达水平均低于EAT低剂量、EAW高剂量组，差异均有统计学意义( q＝22.15、22.96、18.87、21.31，13.42、8.53，4.90，18.57、23.29、16.49、21.11，10.66、12.12，23.70、15.38、13.48、16.73，均 P<0.05)。 结论:EAT和EAW均可减轻四氯化碳诱导的小鼠肝损伤和肝纤维化，可能与抑制ERK1/2、IL-6等表达而影响Ras/ERK-MMP2信号通路有关。

目的 探究罗哌卡因对食管癌细胞KYSE-150增殖、凋亡和迁移的影响,并初步探讨罗哌卡因对KYSE-150细胞作用的相关机制.方法 体外培养KYSE-150细胞,分为对照组、罗哌卡因低、中、高剂量组(10、20、50 μg/mL罗哌卡因).CCK-8法检测KYSE-150细胞的增殖能力;流式细胞仪检测KYSE-150细胞的凋亡情况;细胞划痕实验检测KYSE-150细胞迁移能力;免疫印迹法检测Ras/Raf/MEK/ERK信号通路中Ras、Raf、MEK、ERK蛋白及细胞增殖相关核抗原(Ki-67)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤基因-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达水平变化.结果 与对照组比较,罗哌卡因低、中、高剂量组KYSE-15细胞的细胞存活率降低、凋亡率升高、划痕愈合率降低(P＜0.05);Ki-67、Bcl-2、MMP-2、MMP-9、Ras、Raf、MEK、ERK 蛋白水平下调(P＜0.05),Bax 蛋白水平显著上调(P＜0.05),且呈剂量依赖性.结论 罗哌卡因可抑制KYSE-150细胞增殖与迁移,促进其凋亡,可能是通过抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路实现的.

目的 探讨微小RNA(miR)-30a调控MAPK通路对主动脉夹层大鼠模型夹层形成、炎性因子及血管收缩的影响.方法 选取SD大鼠 50 只,建立主动脉夹层大鼠模型,将其随机分为对照组、模型组、miR-NC组、miR-30a组、miR-30a抑制剂组,各组 10 只.组织病理学染色观察大鼠主动脉组织变化、主动脉中膜弹力纤维与胶原纤维变化;采用PCR、尾动脉压力计、ELISA法对各组miR-30a表达、干预前后收缩压情况、血清炎性因子表达进行检测;采用Western blotting检测各组大鼠基质金属蛋白酶(MMP)-6、MMP-2 蛋白表达以及MAPK通路相关蛋白表达.结果 MiR-30a抑制剂组血管壁撕裂程度和内动脉壁排列紊乱有所改善;miR-30a抑制剂组改善血管重构;与对照组相比,模型组miR-30a表达较高,与miR-NC组相比,miR-30a组、miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05;干预前,各组收缩压比较差异无统计学意义,P>0.05;与对照组相比,模型组收缩压较高,与miR-NC组相比,miR-30a组表达较高,miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05;与对照组相比,模型组肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β表达较高,与miR-NC组相比,miR-30a组表达较高,miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05;与对照组相比,模型组、MMP-6、MMP-2、Ras、Raf、P38 MAPK及ERK1/2 蛋白表达较高,与miR-NC组相比,miR-30a组表达较高,miR-30a抑制剂组表达较低,P<0.05.结论 MiR-30a参与主动脉夹层的形成、炎症反应、调控主动脉夹层血管重构,可能是通过调控MAPK信号通路实现的.

Crocus sativus and its bioactive constituent crocin are well known for anti-tumor potential in different models.However,the efficacy of crocin on in-vivo melanoma metastasis is not yet reported.In this study,melanoma metastatic model was developed by tail vein injection of B 16F-10 cells in to C57BL/6 mice.Metastatic mice treated with two different doses of crocin (250 and 500 μg/kg of bodyweight) for 10 days and parameters such as lung metastasis inhibition,mean survival time,lung hydroxyproline,uronic acid and hexosamine levels were analyzed after 21 days of treatment.Then blood was collected and serum gamma glutamyl transpeptidase (γ-GGT),sialic acid,tumor necrosis factor alpha (TNF-α),interleukin 10 (IL-10),IL-6,IL-2,and TIMP-1 levels were measured.Further,a lung histological examination was done in crocin treated metastatic mice.Subsequently hallmark metastatic parameters such as matrix metalloproteinases (MMPs),extracellular regulated kinase 2 (ERK2),vascular endothelial growth factor (VEGF),and K-ras gene expression were investigated in the lungs of crocin treated metastatic mice.Further,in-vitro adhesion,invasion and migration of B 16F-10 cells were examined after 24 hours of crocin (5 and 10 μg/mL) treatment.Administration of crocin to tumor bearing C57BL/6 mice reduced the lung metastasis by 85％.Elevated levels of hydroxyproline,uronic acid,hexosamine,serum sialic acid and y-GGT in metastatic control were found to be significantly reduced in crocin treated mice.Crocin also inhibited expression ofMMP-2,MMP-9,ERK-2,K-ras,and VEGF.Crocin reduced the ability of B16F-10 cells invasion (P＜ 0.05),migration (P＜ 0.05) and adhesion by upregulating E-cadherin expression.In conclusion,crocin elicited marked anti-metastatic potential by regulating the metastasis induced biomarkers.

目的 探讨Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)促胃癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的分子机制.方法 应用TCGA数据及qPCR法分析Rac1基因在胃癌及其配对正常胃黏膜组织中的表达;慢病毒包装Rac1 shRNA沉默胃癌MGC-803细胞Rac1基因表达;CCK-8、细胞克隆实验检测Rac1基因表达沉默前、后胃癌细胞增殖、克隆能力的变化情况;qPCR、免疫组化、Western blot法检测Rac1基因沉默前、后EMT标志物、ERK1/2及p-ERK1/2表达变化.结果 与配对正常胃黏膜组织相比,Rac1在胃癌组织中的表达增高(P＜0.05),与淋巴结转移、浸润深度、TNM分期相关(P＜0.05).应用慢病毒沉默MGC-803细胞Rac1表达后,与阴性对照组相比,Rac1干扰组细胞增殖、克隆能力显著下调(P＜0.05);胃癌细胞E-cadherin表达上调,N-cadherin、vimentin、Snail、MMP-9表达下调,ERK1/2磷酸化水平明显下降(P＜0.05).结论 Rac1在胃癌组织中高表达,与胃癌浸润、转移、TNM分期有关;下调Rac1基因表达后能抑制胃癌细胞增殖及EMT,可能与阻断ERK1/2磷酸化有关.

目的:探讨透骨消痛胶囊调节Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路抑制骨关节炎炎症反应的作用机制.方法:取4周龄SD雄性大鼠的双侧膝关节软骨,经Ⅱ型胶原酶消化法获得大鼠软骨细胞,并采用Ⅱ型胶原免疫组化法对所得细胞进行鉴定;取第2代软骨细胞分为空白组、模型组(10 ng/mL LPS干预8 h)、抑制剂组(10 ng/mL U0126先干预30 min后再加入10 ng/mL LPS干预8 h)、透骨消痛胶囊组(10 ng/mL LPS+300μg/mL透骨消痛胶囊一同干预8 h).采用Western blot检测软骨细胞中Ras、Raf、p-ERK1/2、MEK1/2、MMP-3和MMP-13蛋白表达,qPCR检测软骨细胞中MEK1/2、ERK1/2、MMP-3和MMP-13基因表达及miR-27b、miR-34a和miR-146a表达.结果:① 软骨细胞经Ⅱ型胶原免疫组化处理后,阳性组细胞胞浆被染为棕黄色,阴性组不显色,表明所提取细胞为软骨细胞.② 与空白组相比,模型组中Ras、Raf、MEK1/2、MMP-3和MMP-13蛋白表达明显升高(P<0.01,P<0.05),p-ERK1/2蛋白表达量也升高,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,抑制剂组与透骨消痛胶囊组Ras、Raf、MEK1/2、p-ERK1/2、MMP-3、MMP-13蛋白表达均下降(P<0.01,P<0.05);透骨消痛胶囊组与模型组相比,MEK1/2蛋白表达降低,但差异无统计学意义(P>0.05).③ 与空白组相比,模型组中MEK1/2、ERK1/2、MMP-3、MMP-13基因表达明显升高(P<0.01);与模型组相比,透骨消痛胶囊组与抑制剂组上述基因表达均下降(P<0.01,P<0.05).④ 模型组miR-27b的表达低于空白组(P<0.01),抑制剂组、透骨消痛胶囊组miR-27b的表达高于模型组(P<0.01);模型组miR-34a、miR-146a的表达均高于空白组(P<0.01,P<0.05),而抑制剂组、透骨消痛胶囊组均低于模型组(P<0.01,P<0.05).结论:透骨消痛胶囊通过调控Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路中关键因子及miR-27b、miR-34a和miR-146a的表达,调节软骨细胞炎症反应,从而抑制骨关节炎炎症,保护关节软骨.

目的:探索南蛇藤乙酸乙醋提取物(celastrus orbiculatus extract,COE)对人胃癌MKN45细胞增殖、侵袭与转移的影响及其可能的分子机制.方法:采用MTT法检测COE对人胃癌MKN45细胞生长增殖的影响;细胞划痕实验及体外侵袭实验检测COE对MKN45细胞侵袭和转移能力的影响;Western Blot法检测经COE作用后的MKN45细胞中金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族蛋白 MMP2、MMP9、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)相关蛋白及ERK/MAPK信号通路相关蛋白的表达.结果:COE可明显抑制MKN45细胞增殖;划痕实验显示COE可降低细胞迁移运动能力;体外侵袭实验显示,经不同浓度(20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1)COE处理过的MKN45细胞透膜数目显著下降;Western Blot结果显示,经不同浓度的COE处理后,细胞中MMP2、MMP9、N-cadherin、Vimention、Ras、Raf、MEK、MEK1/2蛋白表达下调,E-cadherin蛋白表达上调,且呈浓度依赖性.结论:南蛇藤提取物明显抑制人胃癌MKN45细胞的侵袭与转移,其作用机制可能与下调MMP2、MMP9蛋白水平,抑制ERK/MAPK信号通路有关.

目的 探讨分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)对结直肠癌细胞迁移和侵袭的影响机制.方法 本研究起止时间2018年11月至2019年6月.运用实时荧光定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测正常结肠上皮细胞HCoEpiC、人结直肠癌细胞HCT8、SW480、RKO中SFRP1的mRNA表达;将pcDNA 3.1组(转染pcDNA 3.1)、pcDNA 3.1-SFRP1组(转染pcDNA 3.1-SFRP1)、pcDNA 3.1-SFRP1+DMSO组[转染pcDNA 3.1-SFRP1,再用二甲基亚砜(DMSO)处理]、pcDNA 3.1-SFRP1+IGF组[转染pcDNA 3.1-SFRP1,再用丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路激活剂(IGF1)处理],均用脂质体法转染至HCT8细胞.蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞中SFRP1、波形蛋白(Vimentin)、纤维黏连蛋白(FN)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、MAPK/ERK信号通路关键基因(Ras)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)、细胞外信号调节激酶(ERK)的蛋白表达;迁徙实验(Transwell)检测细胞的迁移侵袭.结果 与正常结肠上皮细胞HCoEpiC相比,人结直肠癌细胞HCT8、SW480、RKO中SFRP1的表达显著降低[mRNA(1.00±0.06)比(0.36±0.03)、(0.62±0.05)、(0.59±0.05);蛋白(1.00±0.04)比(0.24±0.02)、(0.48±0.04)、(0.47±0.04),均P<0.05].过表达SFRP1可抑制HCT8细胞的迁移(120±11)比(65±6)和侵袭(98±8)比(47±4),并下调Vimentin(0.96±0.05)比(0.23±0.02)、FN(1.00±0.07)比(0.51±0.04)、MMP-9(0.98±0.08)比(0.35±0.03)、N-cadherin(1.01±0.09)比(0.43±0.04),上调E-cadherin(0.99±0.06)比(3.71±0.27),抑制MAPK/ERK信号通路关键蛋白Ras(0.97±0.07)比(0.34±0.03)、mTOR(1.03±0.07)比(0.42±0.04)、p-ERK1/2(0.98±0.08)比(0.29±0.03)和ERK(1.01±0.06)比(0.31±0.03)的表达.激活MAPK/ERK信号通路可逆转过表达SFRP1对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用.结论 SFRP1可抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭,其机制可能与失活MAPK/ERK信号通路相关,将可为SFRP1用于结直肠癌的治疗提供依据.

目的 探讨miR-655-3p靶向驱动蛋白家族成员20A(KIF20A)对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响.方法 RT-qPCR检测人肺腺癌细胞系H460、A549、HCC-2935、H1299细胞中miR-655-3p的表达;取对数增殖期的A549细胞,分为:空白组、miR-NC组、miR-655-3p mimics组、si-NC组、si-KIF20A组、miR-655-3p mimics+OE-NC组、miR-655-3p mimics+OE-KIF20A组,RT-qPCR检测miR-655-3p表达;Western blot检测KIF20A、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9及RAS/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路相关蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞迁移与侵袭;双荧光素酶报告基因实验验证miR-655-3p与KIF20A的关系.结果 miR-655-3p在人肺腺癌细胞系中低表达,且在A549细胞中的表达量最低;过表达miR-655-3p或沉默KIF20A均能抑制A549细胞增殖、迁移、侵袭及MMP-2、MMP-9、磷酸化细胞外调节蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、磷酸化脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表达(P<0.05);miR-655-3p靶向负调控KIF20A表达,上调KIF20A可抑制过表达miR-655-3p对A549细胞增殖、迁移、侵袭及RAS/MAPK通路相关蛋白的影响.结论 过表达miR-655-3p可靶向下调KIF20A,抑制肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭,该机制可能与抑制RAS/MAPK通路有关.

OBJECTIVE:To study the effects and mechanism of Shenqihuatan formula(参七化痰方,SQHT)of the transforming growth factor-beta(TGF-β)-stimulated cell processes in airway remodeling.METHODS:The current study examined cell viability using a Cell Counting Kit-8 assay.Furthermore,a Transwell assay was conducted to detect the ability of cell migration,and apoptosis was detected via flowcytometry.Western Blot and quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)were used to determine the expression levels of apoptosis or inflammation-related factors,such as TGF-β,lnterleukin-1 β(IL-1β),B cell lymphoma 2(Bcl-2),Bcl-2-Associated X(Bax),Ras homolog gene family,member A(RhoA),recombinant rho associated coiled coil containing protein kinase 1/2(ROCK1/2),extracellular regulated protein kinases 1/2(ERK1/2),Snail,and Slug.Finally,the expression levels of matrix metalloproteinase-9(MMP-9)and Tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP-1)were admeasured by enzyme-linked immuno sorbent assay.RESULTS:The results demonstrated that SQHT inhibited the viability and migration,as well as the the F-actin formation and cytoskeletal reorganization of airway smooth muscle cells(ASMCs)stimulated by TGF-β.By monitoring the changes of critical regulators in the presence of the formula,it was observed that the expression levels of TGF-β,IL-1β,Bcl-2,RhoA,ROCK1/2,ERK1/2,Snail,and Slug were markedly suppressed,whereas Bax expression exhibited the opposite effect.Compared with a well-characterized RhoA pathway inhibitor,Fasudil,SQHT generated equivalent or even higher inhibitory effects on these processes in ASMCs.CONCLUSIONS:Collectively,these suggested that SQHT can reduce airway inflammation by inhibiting TGF-β-stimulated signaling pathways in ASMCs.These findings may provide a novel remedy for treating ASMC inflammation,which causes thickening and obstruction of the airway in chronic obstructive pulmonary disease.