目的:探讨基于软骨脱细胞外基质微载体体外构建具有功能化和自我更新能力的软骨类器官。方法:取新鲜的猪关节软骨，将部分仅粉碎处理的软骨微粒设置为天然软骨组；利用物理离心化学萃取相结合的脱细胞方法，制备粒径合适的细胞外基质（ECM）微载体，设置为微载体组。通过旋转式生物反应器将人脐带干间充质干细胞（hUCMSCs）和人软骨细胞（hCho）按照3∶1的比例与微载体负载，体外构建软骨类器官，将诱导不同时间的类器官分为诱导0、7、14及21 d组。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）荧光染色观察、DNA定量评估微载体组和天然软骨组细胞残留情况；番红O、甲苯胺蓝染色观察微载体ECM保留情况，二甲氨基苯甲醛比色法测定微载体组和天然软骨组胶原蛋白含量；二甲基亚甲蓝（DMMB）比色法测定微载体组和天然软骨组糖胺聚糖（GAGs）含量。扫描电镜及能谱分析对微载体进行进一步表征；将添加体积分数10%胎牛血清（FBS）的杜尔伯克改良伊戈尔低糖培养基（DMEM）培养的hUCMSCs作为对照组，将微载体浸提液培养的hUCMSCs作为实验组，两组分别设置培养1、3、5 d共3个时间点的亚组，细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）检测两组生物相容性。活死染色检测诱导0、7、14及21 d组的软骨类器官细胞活性，Ki67荧光染色鉴定诱导14 d软骨类器官的自我更新能力。RT-PCR测定诱导7、14、21 d组的软骨类器官，包括软骨形成相关标记物聚蛋白聚糖（ACAN）、Ⅱ型胶原（COL2A1）、性别决定区Y框蛋白9（SOX9）及软骨肥大、矿化相关标记物Ⅰ型胶原（COL1A1）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨钙素（OCN）的表达水平；比色法和DMMB法测定诱导0、7、14及21 d组的类器官分泌胶原蛋白和GAGs能力。结果:DAPI荧光染色结果显示，天然软骨组具有大量细胞核，而微载体组则基本无细胞核。微载体组DNA含量为（7.8±1.8）ng/mg，较天然软骨组的（526.7±14.7）ng/mg显著降低（ P<0.01）。番红O、甲苯胺蓝染色可见微载体着色较深且均一，保留大量软骨ECM成分。微载体组胶原蛋白含量为（252.9±1.4）μg/mg，GAGs含量为（173.4±0.8）μg/mg，均显著低于天然软骨组的（311.9±2.2）μg/mg、（241.3±0.7）μg/mg（ P<0.01）。扫描电镜显示，微载体表面有凹凸不平相互交错的胶原纤维网络。能谱分析结果显示，C、O、N元素均匀分布在微载体，表明该微载体成分组成均匀。微载体生物相容性良好，培养1、3 d时，对照组和实验组CCK-8实验结果比较，差异均无统计学意义（ P>0.05）；培养5 d，实验组 A值为0.53±0.02，优于对照组的0.44±0.03（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组中，hUCMSCs和hCho贴附在微载体表面且细胞活性好，活死比例分别为（70.6±1.1）%、（80.5±0.6）%、（94.5±0.9）%、（90.8±0.5）%（ P<0.01）；诱导14 d时，软骨类器官有大量Ki67阳性细胞。RT-PCR显示，诱导7 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为1.00±0.09、1.00±0.24、1.00±0.18、1.00±0.03、1.00±0.06、1.00±0.13；诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为4.16±0.28、5.09±1.25、5.65±1.05、0.47±0.01、1.68±0.02、0.21±0.06；诱导21 d组ACAN、COL2A1、SOX9、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平分别为13.42±0.92、3.07±0.21、1.84±1.08、2.72±0.17、2.91±0.18、3.32±1.20。与诱导7 d组比较，诱导14 d组ACAN、COL2A1、SOX9、RUNX2表达水平均升高（ P<0.05），COL1A1表达水平降低（ P<0.05），OCN表达水平差异无统计学意义（ P>0.05）；与诱导7 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2表达水平均显著升高（ P<0.01），COL2A1、SOX9、OCN表达水平差异均无统计学意义（ P>0.05）；与诱导14 d组比较，诱导21 d组ACAN、COL1A1、RUNX2、OCN表达水平均升高（ P<0.05或0.01），COL2A1表达水平差异无统计学意义（ P>0.05），SOX9表达水平降低（ P<0.05）。诱导0、7、14及21 d组胶原蛋白含量分别为（219.15±0.48）μg/mg、（264.07±1.58）μg/mg、（270.83±0.84）μg/mg、（280.01±0.48）μg/mg，GAGs含量分别为（171.18±1.09）μg/mg、（184.06±1.37）μg/mg、（241.08±0.84）μg/mg、（201.14±0.17）μg/mg。与诱导0 d组比较，诱导7、14、21 d组胶原蛋白和GAGs含量均显著升高（ P<0.01）。在诱导7、14、21 d组中，诱导7 d组胶原蛋白含量最低（ P<0.01），诱导21 d组胶原蛋白含量最高（ P<0.01）；诱导7 d组GAGs含量最低（ P<0.01），诱导14 d组GAGs含量最高（ P<0.01）。 结论:物理化学方法结合制备的微载体脱细胞成功，其基质保留较多，成分均一且无细胞毒性。基于微载体负载hUCMSCs与hCho体外成功构建软骨类器官，具有细胞活性好、自我更新能力、软骨形成相关基因表达强及分泌胶原蛋白和GAGs等特点，诱导14 d时构建的软骨类器官成软骨活性最佳。

目的:研究SRY盒转录因子7（ SOX7）基因甲基化在肾癌中的临床价值及对肾癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。 方法:选择80例肾癌患者（肾癌组）及50例肾脏良性疾病患者（对照组）为研究对象。设计合成寡核苷酸序列（MON、UMON和CON）并转染至肾癌细胞A498。采用甲基特异性PCR检测肾癌患者（肿瘤组织、癌旁组织）和对照组肾脏组织中 SOX7基因甲基化状态，分析 SOX7基因甲基化与临床病理因素的关系，MTT法检测 SOX7基因甲基化对肾癌细胞增殖的影响，Transwell小室法检测 SOX7基因甲基化对肾癌细胞迁移和侵袭的影响。 结果:肾癌组患者肿瘤组织 SOX7基因甲基化率高于癌旁组织和对照组肾脏组织，差异有统计学意义（χ 2＝67.522， P<0.05）。肾癌细胞Caki-1、786-O、769-P中 SOX7基因呈甲基化状态，而在A498细胞中呈未甲基化状态。肾癌组患者肿瘤组织 SOX7基因甲基化率在性别、年龄及病理类型方面比较差异无统计学意义（均 P>0.05），在分化程度、肿瘤最大径、淋巴结转移、肿瘤数量及肿瘤分期方面比较差异均有统计学意义（均 P<0.05）。转染MON后可成功诱导A498细胞 SOX7基因甲基化，MON组A498细胞第1~7天细胞活力高于UMON组和CON组（ P<0.05）。 结论:SOX7基因甲基化可促进肾癌细胞增殖、迁移和侵袭，在肾癌的病情及预后评估中具有重要临床价值。

目的:探讨尼克酰胺(NIC)在人胚胎干细胞(hESCs)诱导分化为神经嵴细胞过程中的作用，为hESCs进一步分化为角膜内皮细胞提供实验基础。方法:取培养5~7 d的hESCs细胞系H1进行诱导，根据诱导培养基中干预组分的不同分为未添加NIC组(仅使用诱导培养基)、NIC添加组(含10 mmol/L NIC的诱导培养基)、NIC+白藜芦醇(Res)组(含10 mmol/L NIC、10 μmol/L Res的诱导培养基)和Sirtinol组(含10 μmol/L Sirtinol的诱导培养基)，其中Res和Sirtinol分别为SIRT1活性激动剂和抑制剂，各组连续诱导7 d。采用实时荧光定量PCR法检测诱导1、3、5、7 d hESCs及神经嵴细胞标志物mRNA相对表达量；诱导后7 d，采用免疫荧光染色法测定hESCs来源神经嵴细胞相关标志蛋白的表达，采用流式细胞术分析hESCs来源神经嵴细胞表面标志物神经生长因子受体(P75)和人自然杀伤因子1(HNK-1)阳性细胞比率，以评价NIC诱导效率及调控SIRT1对HNK-1表达的影响。结果:与未添加NIC组相比，NIC添加组处理5 d后全能性基因八聚体结合转录因子4(OCT4)和同源域蛋白(NANOG) mRNA相对表达量显著降低，神经嵴细胞标志物P75、HNK-1、SRY相关HMG盒9(SOX9)和SOX10 mRNA相对表达量显著升高，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。免疫荧光染色结果显示，未添加NIC组神经嵴细胞标志物P75表达较弱，HNK-1仅有零星表达，转录因子激活蛋白2β(AP-2β)及成对样同源域转录因子2(PITX2)均未见阳性着色；NIC添加组细胞中P75、HNK-1、AP-2β及PITX2均呈广泛的强阳性表达。NIC添加组P75 +HNK-1 +和P75 +细胞比率明显高于未添加NIC组，差异均有统计学意义( t＝8.481， P＝0.001； t＝2.987， P＝0.041)。未添加NIC组、NIC添加组、NIC+Res组和Sirtinol组HNK-1 +细胞比率分别为(34.267±12.522)%、(89.633±1.358)%、(64.667±6.429)%和(86.300±3.460)%，总体比较差异有统计学意义( F＝36.799， P<0.001)，其中，NIC+Res组HNK-1 +细胞比率均明显低于NIC添加组和Sirtinol组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。 结论:NIC可通过抑制SIRT1的活性促进HNK-1表达，提高hESCs来源神经嵴细胞的分化效率，为神经嵴细胞相关疾病的治疗，如角膜内皮移植提供新的种子细胞来源。

目的:建立通过小分子化合物将大鼠胚胎成纤维细胞(REF)重编程为化学诱导神经元(ciNC)的方法体系,为细胞移植治疗神经退行性疾病提供安全有效的供体细胞.方法:以裴钢研究团队建立的人成纤维细胞直接重编程为神经元的方法为基础,通过更换包被液、缓解氧化应激损伤、添加神经源性保护因子、调整毛喉素浓度和小分子去除实验对诱导培养基和成熟培养基进行优化,并通过免疫荧光法和蛋白质印迹法验证不同诱导阶段细胞的相关蛋白质.结果:以原方案进行诱导时,细胞存活率仅(34.24±2.77)%.包被液更换为基质胶后,细胞存活率上升到(45.41±4.27)%;添加褪黑素后细胞存活率提高至(67.95±5.61)%,(23.43±1.42)%的细胞转变为神经样细胞;添加小分子P7C3-A20后细胞存活率进一步提升至(76.27±1.41)%,(39.72±4.75)%的细胞转变为神经样细胞;毛喉素浓度提升至30 μmol/L时,神经样细胞比例达到(55.79±1.90)%;去除SP600125后,(86.96±2.15)%细胞存活,神经样细胞生成率提高至(63.43±1.60)%.以优化后的方案诱导,可经过神经前体细胞将REF诱导为ciNC.其中,神经前体细胞能够高表达神经前体细胞标志物SRY-box转录因子2、配对盒6以及神经元特异性标志物Ⅲ类β-微管蛋白,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达量减少.神经前体细胞在成熟培养基中诱导两周后,可见大部分细胞呈神经样细胞形态,诱导后的ciNC高表达Ⅲ类β-微管蛋白和微管相关蛋白2,而成纤维相关蛋白波形蛋白表达减少.结论:优化后的小分子组合在常氧条件下能将REF重编程为ciNC.

目的 研究中药脊髓康含药血清联合SRY转录盒因子2(SOX2)诱导星形胶质细胞重编程为神经元的作用机制.方法 将30只成年SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(SCI组)和治疗组,10只/组.SCI组和治疗组均采用改良Allen法构建脊髓损伤大鼠模型,于术后分别给予生理盐水、脊髓康等量灌胃.在术前1 d、术后3、7、14 d进行Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分和斜板实验.相同方法构建脊髓损伤大鼠模型,提取损伤部位组织进行单细胞RNA测序,再使用生物信息学对"脊髓康"、"脊髓损伤"、"糖酵解"关联基因进行靶点分析.成年SD大鼠以生药量15 g·kg-1·d-1脊髓康灌胃,连续3 d后腹主动脉采血制备脊髓康含药血清.体外培养大鼠幼仔皮层脑组织三代星形胶质细胞,分为SOX2组、SOX2+JSK组.SOX2组加入10 mmol/L SOX2;SOX2+JSK组加入10 mmol/L SOX2、2.5％脊髓康含药血清.培养21 d后,Western blot检测细胞中丙酮酸激酶M2型(PKM2)、磷酸化丙酮酸激酶M2型(p-PKM2)、Yes-相关蛋白(YAP)表达,使用免疫荧光多标染色观测PKM2与YAP共定位情况.结果 治疗组大鼠的BBB评分与斜板实验角度明显提升,且各时段均优于SCI组(P<0.05).SCI部位PKM2基因在各类细胞中均有高活性表达;生物信息学分析靶点指向HIPPO-YAP信号通路;与SOX2组比较,整个细胞中SOX2+JSK组PKM2表达增高(P<0.05)、p-PKM2、YAP表达亦升高(P<0.001),且更多PKM2磷酸化入核.SOX2+JSK组PKM2与YAP共定位情况高于SOX2组.结论 中药脊髓康含药血清联合SOX2可能通过提高糖酵解中PKM2与YAP共定位,从而将星形胶质细胞重编程诱导为神经元细胞,促进神经损伤修复.

目的 比较H2O2和LPS干预两种髓核细胞退变诱导模型效果,及其对ECM代谢平衡的影响.方法 提取SD大鼠第7-12尾椎椎间盘髓核细胞进行分离培养传代,取第三代髓核细胞,分别采用75μmol/L H2O2、10μmol/L LPS干预12 h后,Western blot检测二型胶原(collagenⅡ,Col-2)、Y染色体性别决定区-盒转录因子9(SRY-box transcription factor 9,SOX9)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases 9,MMP9)及13(matrix metalloproteinases 13,MMP13)表达,PCR检测Col-2、SOX9、MMP9及MMP13转录水平,通过免疫荧光染色观察Col-2、SOX9、MMP9及MMP13的分布及表达变化情况.结果 H2O2和LPS干预12 h,均能成功建立髓核细胞体外退变模型.引起ECM合成代谢减少,分解代谢增加.结论 LPS对ECM合成代谢相关基因表达的抑制作用更为显著,而H2O2更为明显地促进了ECM分解代谢相关基因的表达.

目的:检测miR-452-5p在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达,并探讨其异常表达对食管癌KYSE-150细胞增殖、侵袭能力和EMT进程的影响及其分子机制.方法:收集2012年3月至2015年12月在河北医科大学第四医院就诊的86名ESCC患者的癌组织样本和对应的癌旁组织,用qPCR法检测miR-452-5p及其他相关基因在ESCC组织和细胞中的表达;向KYSE-150细胞中分别转染miR-452-5p mimic或pcDNA3.1-SOX7构建过表达的细胞株.分析miR-452-5p表达与ESCC病理特征和患者5年OS的关系.用MTS、Tanswell法检测miR-452-5p过表达对食管癌KYSE-150细胞增殖、侵袭能力和EMT进程的影响;用双荧光素酶报告基因实验及TOP/FOP报告基因系统检测miR-452-5p与SRY盒转录因子(SOX7)3'UTR区的结合作用及对Wnt/β-catenin通路活化水平的影响.结果:miR-452-5p在ESCC组织中呈明显高表达(P＜0.01),并与ESCC患者的淋巴结转移、TNM分期及5年OS密切相关(均P＜0.01).miR-452-5p过表达明显促进食管癌KYSE-150细胞的增殖、侵袭能力及EMT进程(P＜0.05或P＜0.01).SOX7是miR-452-5p的直接靶基因,miR-452-5p通过对SOX7的负向调控影响了 Wnt通路活化水平(P＜0.05或P＜0.01),同时,miR-452-5p表达也受Wnt通路活化水平的影响(P＜0.05或P＜0.01),其可能为Wnt通路下游靶基因.结论:miR-452-5p通过miR-452-5p/SOX7/Wnt/miR-452-5p正反馈环路提高Wnt/β-catenin通路活化水平,进而促进ESCC KYSE-150细胞的增殖、侵袭能力及EMT进程,miR-452-5p有望成为ESCC患者靶向治疗的潜在靶点及预后评估的新型分子标志物.

目的 分析低剂量螺旋CT(LDCT)联合血清肺癌自身抗体在肺癌早期诊断中的价值.方法 选取2020 年8 月—2022 年8 月延安市人民医院呼吸与危重症医学科收治肺癌患者120 例为肺癌组,另选取同期医院收治肺部良性病变患者46 例为对照组,均进行LDCT扫描,采用酶联免疫吸附法检测血清肺癌7 项肿瘤相关自身抗体[7-TAAB,包括p53、蛋白基因产物9.5(PGP9.5)、SRY盒转录因子 2(SOX2)、G抗原 7(GAGE7)、ATP结合RNA解旋酶(GBU4-5)、黑色素瘤抗原A1(MAGE A1)、肿瘤相关基因(CAGE)]水平.采用受试者工作特征曲线(ROC)分析LDCT联合血清7-TAAB在肺癌早期诊断中的价值.结果 肺癌组CT征象中磨玻璃结节、支气管充气征、空泡征、胸膜凹陷征、毛刺征、分叶征比例高于对照组(χ2/P=5.743/0.017、8.260/0.004、7.275/0.007、11.499/0.001、14.118/＜0.001、11.474/0.001).166 例患者中,LDCT诊断肺癌阳性病例114 例、阴性病例52 例,24 例肺癌误诊为良性病变,28 例肺部良性病变误诊为肺癌.肺癌组血清p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE A1、CAGE水平均高于对照组(Z = 5.168、4.170、4.660、4.561、4.039、5.528、4.981,P均＜0.001).肺癌组血清p53、SOX2、GAGE7、MAGE A1、CAGE、7-TAAB阳性率高于对照组(χ2/P =18.669/＜0.001、9.114/0.005、13.676/＜0.001、12.377/＜0.001、6.794/0.009、27.041/＜0.001).LDCT、血清7-TAAB及二者联合诊断早期肺癌的曲线下面积分别为0.704、0.725、0.886,LDCT联合7-TAAB 诊断效能高于单项指标(Z=4.000、4.184,P均＜0.001).结论 LDCT联合血清肺癌自身抗体对肺癌早期诊断的价值较高.