目的:探讨宏基因二代测序技术检测尿路感染患者尿液中多瘤病毒的临床价值。方法:2018年9月至2020年4月复旦大学附属中山医院收治的送检尿液宏基因二代测序的尿路感染患者共33例。采用随机扩增法、脱氧核糖核酸纳米球、华大基因公司BGI-500测序平台及BWA算法为基础的比对法等技术对尿液标本的核酸提取物进行二代测序分析，以尿标本中多瘤病毒核酸序列数>100为入选标准，分析检出多瘤病毒的类型、深度、覆盖度、丰度及序列数等参数。采用Taq Man探针实时定量聚合酶链反应（PCR）法验证并检测多瘤病毒DNA载量。结果:30.3%（10/33）的患者尿标本中检出JC多瘤病毒，其中1例合并检出BK多瘤病毒。所有患者在检测前均使用抗菌药物治疗，但仅一例尿培养阳性。JC多瘤病毒检出的深度均值为35.9，覆盖度均值96.8%，相对丰度均值92.6%，唯一比对序列数均值为3 154。实时定量PCR法检测10例患者尿中JC多瘤病毒DNA载量在5.84×10 3~6.55×10 8拷贝/ml，均值为6.82×10 7拷贝/ml，其中9例患者（均为免疫受损者）的病毒载量超过5×10 4拷贝/ml，与宏基因二代测序结果基本相符。每1 M数据中的严格比对序列数（RPM）与CD4 +T细胞计数存在线性负相关（ R2=0.84， P=0.004）。其中1例患者经西多福韦治疗后症状及尿检指标好转，随访尿液宏基因二代测序检查JC多瘤病毒的序列数及RPM值明显下降，实时定量PCR法证实尿中病毒DNA载量亦下降。 结论:宏基因二代测序技术在病毒性尿路感染的诊断中有着重要意义。西多福韦可能是治疗多瘤病毒尿路感染的一个选择。

目的 采用快速分子诊断方法中TaqMan荧光定量PCR技术,应用于利福平和异烟肼一线抗结核药物耐药基因的诊断中,评价其性能,建立高灵敏度、高特异度、高准确性并且快速的筛查方法,为结核分枝杆菌耐药性的诊断和治疗提供依据并探讨其应用价值,努力改善耐药结核病的检测和可行性.方法 本研究针对利福平ropB基因531位点突变和异烟肼katG基因315位点突变的特点,设计TaqMan-MGB引物和探针,通过反应条件优化,建立TaqMan荧光定量PCR方法;用克隆到pUC57载体上的阳性标准品及不同菌株评价该方法的特异性、灵敏度、重复性和精密度,采用甘油三酯、胆红素和血红素进行了干扰性实验.结果 TaqMan荧光定量PCR方法的检测限可达10copies/μl;在交叉干扰实验中,检测了 5种常见呼吸道感染细菌国家标准菌株,均未检出,基因野生型和突变型探针特异性较好,不受其它基因干扰;批内、批间的CT值变异系数均小于5％,标准曲线R2=0.998,扩增效率均在90％以上;该反应迅速,检测时间为1h.结论 本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法有助于及时发现结核分枝杆菌耐药情况,对结核病的耐药检测与后续治疗具有重要意义.

[背景]兰花环斑病毒(cymbidium ringspot virus,CymRSV)是一类重要的检疫性病毒,在世界范围内危害严重.[目的]建立一种特异性强、灵敏度高且能定量分析 CymRSV 携带情况的高效检测方法.[方法]通过比对 5 个CymRSV CP基因序列,利用高度保守区设计 3 对引物探针并优化筛选后,获得 145 bp的靶标序列及对应的最优引物及探针组合.以该靶标序列为模板构建阳性重组质粒,建立标准曲线,并探究其灵敏度、特异性、稳定性和应用效果.[结果]建立的CymRSV实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测法对阳性质粒标准品的最低检出限可达 1 copy,最低稳定检出限达 5 copies/μL,是逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)灵敏度的 103-104 倍;标准曲线y=-3.332x+40.371 显示,Ct值与拷贝数的对数线性关系良好,扩增效率为 99.6%,相关系数R2 为 0.999;与其他 5 种常见病毒反应均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数均小于 0.6%,重复性和稳定性较好.利用该方法对 4 类不同种属的 20 个兰花样品进行检测,阳性对照在 Ct为23.31 出现扩增曲线,阴性对照及样品未出现扩增曲线.[结论]基于Taq Man探针的CymRSV实时荧光定量PCR检测方法的成功创建,可为开展兰花CymRSV病毒的精准检测与科学防控提供技术支撑.

目的 探讨蛋白激酶Cβ(PKCβ)基因多态性与类风湿性关节炎(RA)患者遗传易感性及疾病的相关性.方法 选取确诊的RA患者400例(病例组),收集时间2013年1月至2016年1月,同期体检健康对象400例作为对照组.采用TaqMan探针基因分型技术检测两组对象PKCβ基因rs16972959位点的基因型,并分析不同基因型与RA患者各实验室指标、临床特征之间的关系.结果 病例组患者的PKCβ基因rs16972959位点的基因型频率为GG54.75%,GA37.50%,AA7.75%,对照组PKCβ基因rs16972959位点的基因型频率为GG52.75%,GA40.00%,AA7.25%,两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);病例组PKCβ基因rs16972959位点等位基因频率为G73.50%,A26.50%,对照组PKCβ基因rs16972959位点等位基因频率为G72.50%,A27.50%,两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05).RA患者中RF阳性患者的AA基因型频率(9.51%)显著的高于RF阴性患者(2.11%)(P<0.05);AA、GA基因型患者的关节肿胀数目、关节触痛数目均显著的高于GG患者(P<0.05).结论 PKCβ基因多态性与RA患者遗传易感性无明显的相关性,但是与RF因子阳性率、患者的临床表现具有一定的关系.

目的:探究云南地区汉族人群中细胞表面糖蛋白CD6基因多态性与非小细胞肺癌(NSCLC)的相关性.方法:选取云南汉族NSCLC患者467例作为病例组,选取同期健康正常人群490例作为对照组,采用Taq-Man探针基因分型方法对CD6基因的SNP位点(rs12360861、rs1 1230563及rs 17824933)进行基因分型,分析3个SNP位点等位基因和基因型在病例组和对照组间的分布差异,分析3个SNP位点在肺癌不同临床分期的中分布.结果:CD6基因的SNP位点(rs12360861、rs11230563及rs17824933)的等位基因、基因型和构建的单倍型在病例组与对照组中的分布频率比较,差异无统计学意义(P ＞0.05);CD6基因的3个SNP位点的等位基因、基因型在肺癌Ⅰ+Ⅱ期组和Ⅲ+Ⅳ期组间的分布频率比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:CD6基因的rs 12360861、rs11230563及rs 17824933多态性位点可能与云南汉族人群NSCLC的发生发展无相关性.

目的 分析前列腺癌患者癌组织中miRNA-21(miR-21)表达水平及与预后的关系.方法 回顾性分析2011年1月—2012年6月四川大学华西医院76例前列腺癌行手术切除患者资料,采用特异性Taq-Man探针实时定量PCR法检测患者切除前列腺癌组织及癌旁前列腺组织miR-21表达水平,分析其与患者预后的关系.结果 miR-21在前列腺癌组织中相对表达量为(2.68±0.54),明显高于癌旁组织的(1.14±0.42)(t=19.62,P<0.05);前列腺癌患者miR-21高表达者57例(75％),低表达者19例(25％),2组TNM分期、Gl-eason评分、复发转移比较,差异均有统计学意义(P<0.05),而年龄、前列腺体积、血清前列腺特异抗原水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);miR-21表达量低组平均生存期32.5个月,miR-21表达量高组平均生存期24.8个月,经Kaplan-Meier生存分析显示,2组差异有统计学意义(P=0.019).结论 miR-21在前列腺癌患者癌组织中具有高表达现象,对前列腺癌的诊断及预后评价具有指导意义.

背景:目前对于造血干细胞移植后的免疫监测缺乏直接明确的检测指标,利用不断改良的实时定量荧光PCR技术监测T细胞受体删除环(T-cell receptor excision circle,TREC或signal joint T-cell receptor excision circle,sjTREC)拷贝数来反映胸腺新近功能,从而评估免疫重建水平,指导预后治疗.目的:检测造血干细胞移植患者免疫重建早期T细胞受体删除环水平,分析移植方式、年龄、疾病类型、性别等因素的影响.方法:采用Taq Man探针,实时定量荧光PCR技术检测29例健康正常人,19例造血干细胞移植前患者,6例造血干细胞移植后患者的外周血1 000个细胞中所含sjTREC拷贝数.结果与结论:①正常对照组1 000个细胞中所含sjTREC拷贝数为26.99±29.3,随年龄增加而降低,男女性别 sjTREC 水平无明显差异;患者组移植前 sjTREC 水平低于正常对照组且差异有显著性意义(P=0.006);②6例患者移植后1个月时sjTREC水平上升,移植后6个月时sjTREC水平下降;③移植后6个月时2例HLA半相合亲缘移植与4例HLA全相合非亲缘移植患者sjTREC水平接近;④结果表明,移植前患者胸腺功能严重受损,在移植后 1 个月出现短暂上升后下降的趋势可能与胸腺应激性反应相关;亲缘与非亲缘移植、男性与女性、不同年龄患者等单因素分析未见明显差异,但移植后 sjTREC 水平上升反映了移植后胸腺新近输出功能的变化,体现了免疫重建受多种因素的影响.

为了建立可同时检测鲤浮肿病毒(Carp edema virus,CEV)和锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)的检测方法,本研究根据CEV P4a基因保守序列,对英国环境、渔业水产养殖研究中心(Center for Environment,Fisheries and Aquaculture Science,CEFAS)设计合成的引物序列进行优化,合成1对特异性引物和1条用FAM荧光基团标记的TaqMan探针;根据KHV ORF7基因保守序列,设计筛选1对特异性引物和1条用VIC荧光基团标记的Taq-Man探针.优化反应条件,建立了CEV和KHV双重实时荧光定量PCR检测方法.结果显示该方法特异性强,与其它水生动物病毒无交叉反应;灵敏度高,对CEV和KHV的检测限均为15拷贝数/μL;组内重复与组间重复的平均变异系数小于3％.本研究建立的方法具有快速、特异、敏感等优点,可用于CEV和KHV的快速检测.

目的:探究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶p22phox亚基CY-BA基因的C242T位点单核苷酸多态性与重度子痫前期(PE)的相关性.方法:通过Taq-Man探针进行实时荧光定量PCR,对1184例重度PE孕妇和1421例健康对照者进行CY-BA基因C242T多态性分析.结果:重度PE孕妇与健康对照孕妇比较,CYBA基因C242T基因型和等位基因频率分布均无显著差异(P＞0.05);早发型、晚发型重度PE孕妇分别与健康对照孕妇比较,基因型和等位基因频率分布均无显著差异(P＞0.05);早发型和晚发型重度PE孕妇比较,基因型及等位基因频率分布均无显著差异(P＞0.05).结论:CY-BA基因C242T基因多态性可能与重度PE发生无相关性.

目的:研究CD133基因3-UTR区域的 (rs2240688和rs3130) 单核苷酸多态性位点 (SNPs) 与云南汉族人群宫颈癌的相关性.方法:选取云南汉族宫颈癌患者428例作为病例组, 455例云南汉族健康个体作为对照组;采用Taq Man探针基因分型方法对2组受试者CD133基因中rs2240688和rs3130位点进行基因分型, 并采用χ2检验分析上述两SNPs位点等位基因、基因型及构建的单倍型分布频率在病例组与对照组中的差异.结果:rs2240688位点等位基因和基因型分布频率在病例组和对照组比较, 差异具有统计学意义 (P=0.019、0.040), 该位点等位基因G是宫颈癌的风险性因素 (OR=1.292, 95％CI为1.042～1.601);而rs3130位点等位基因和基因型分布频率在病例组和对照组比较, 差异无统计学意义 (P＞0.05);单倍型分析结果显示, 单倍型rs2240688G-rs3130C是宫颈癌发生的风险性因素 (P=0.023, OR=1.300, 95％CI为1.037～1.630) .结论:CD133基因3-UTR区域的SNP位点rs2240688与云南汉族人群宫颈癌的发病风险相关, 该位点等位基因G可能是宫颈癌发生的风险性因素.