本研究根据Ty1-copia类反转录转座子反转录酶的保守区设计简并引物,通过PCR扩增,从裸燕麦(Avena nuda L.)品种‘品燕1号’基因组中分离获得23条Ty1-copia类反转录转座子序列,并对序列特征、系统发育关系及其转录活性进行分析.结果显示,23条Ty1-copia类反转录转座子存在较高的异质性,序列间的一致性为45％～98％,存在插入、移码和终止密码突变,但频率不高;系统发育分析结果表明,燕麦Ty1-copia类反转录转座子在进化过程中主要为垂直传递.本研究通过检索燕麦基因表达数据库,发现了5个有转录活性的Ty1-copia类反转录转座子.

为深入研究大茎野生种Ty1-copia反转录转座子逆转录酶序列(RT,reverse transcriptase)的特点,本研究使用简并引物将Ty 1-copia RT序列克隆、测序,成功分离了60条Ty1-copia类RT序列,AT比例为46.0％～62.0％,长度为257～266bp,通过构建系统进化树分析,可将其分成6大类.将这些碱基序列翻译成氨基酸序列,通过ClustalX软件分析,发现存在上游TAFLHG、下游YVDDM以及中心SLYGLKQ保守结构域,并出现编码阅读框移码突变、终止密码子突变的现象.与其他禾本科物种的Ty1-copia RT序列一起构建系统进化树,结果发现可分成10类不同的进化谱系,60条大茎野生种Ty1-copia RT氨基酸序列中有12条序列归为Ⅰ类(Sre/Maximus)、有10条序列归为Ⅱ类(Retrofit/Ale)、有18条序列归为Ⅲ类(Ale)、有17条序列归为X类(Tork/TAR),仅有3条序列归为Ⅵ类(Tork/Angela);然而Bianca和Oryco/Ivana谱系未发现大茎野生种Ty1-copia RT序列,表明其与甘蔗杂交种、高粱的亲缘关系近.通过斑点杂交结果,可计算得到Ty1-copia RT序列在其基因组中拷贝数为6.75×103.FISH结果显示,Ty1-copia RT序列是弥散分布在染色体上,其中部分染色体端粒上的信号比较强.这些结果将有助于今后大茎野生种生物多样性研究、基因组研究,提供一定的参考依据.

该研究旨在克隆Ty1-copia类反转录转座子RT(reverse transcriptase)基因,为分离花生属Ty1-copia类反转录转座子全长序列和研究其功能提供序列基础.根据RT基因的保守区设计简并引物,以两份AA染色体组野生种花生Arachis duranensis为试材,利用PCR扩增其基因组DNA,回收、克隆和测序目的条带后,对所获得序列进行生物信息学分析.结果表明:(1)目的条带大小约为260 bp,分别从两份野生种花生材料中克隆到41条和27条RT基因序列,68条序列的长度变化范围为256～270 bp,AT所占比例范围为55.86％～68.42％,AT与GC比例范围为1.27～2.17,核苷酸序列间相似性范围为49.8％～99.2％,存在较高异质性.(2)68条序列被分为6个家族,家族Ⅰ和Ⅳ为主要家庭.(3)68条序列中的19条发生了无义突变,A.duranensis(PI219823)要比A.duranensis(PI262133)的无义突变率高.(4)氨基酸序列间相似性为4.7％～100％,呈现高度异质性.(5)各家族中代表序列的蛋白质三级结构在整体构型上一致,但在螺旋结构数、折叠结构数、转角数和氢键数上存在较大差别.(6)序列间保守基序总体一致,但也存在一定变异,呈现一定异质性;系统进化树将68条序列分为10类,大部分序列都聚在A和B两大类中.(7)另有部分AA染色体组野生种花生的RT基因序列与其他物种植物的RT基因序列亲缘关系较近,推测不同物种植物间可能发生过Ty1-copia类反转录转座子的横向传递.该研究为花生属基于Ty1-copia类反转录转座子的新分子标记开发和应用奠定基础.

利用简并PCR技术从野生花生种(Arachis ipaensis Krapov.et W.C.Greg.)的基因组中扩增分离Ty1-copia类(1类)和Ty3-gypsy类(2类)反转录转座子RT基因,并对其序列特征、多样性、系统进化关系及转录活性进行分析.结果显示:对于1和2类RT基因,目的条带分别约为260和430 bp;分离获得了23和32条序列,长度范围分别为262～266、395～435 bp;AT所占比例分别为61.60％ ～69.17％和55.79％ ～61.34％;核苷酸序列间相似性分别为52.5％ ～98.9％和45.0％ ～98.8％,氨基酸序列间相似性分别为39.8％ ～100％和9.0％ ～97.2％.其中2类基因的异质性高于1类;1类和2类基因分别有3条和15条发生了无义突变,2类的无义突变发生率远高于1类.1类基因的保守基序保守性较高,2类的保守基序呈一定程度的变异.代表序列的蛋白质三级结构基本类似.聚类分析结果显示,1类和2类基因可被分为5个和6个家族.1类和2类基因都有部分序列与其他物种的RT基因序列亲缘关系较近,表明它们之间可能存在两类反转录转座子的横向传递.通过比对花生EST数据库,本研究发现1类有1条以及2类有7条序列为具有转录活性的反转录转座子,且2类基因比1类更具有转录活性.