目的:制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体，为后续研究奠定基础。方法:采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼，从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆，ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列，最后得到个5非冗余序列，分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株，在16 ℃下进行胞间质可溶性表达，经Ni亲和柱纯化表达后，Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果:经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×10 8 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明，5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%，且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性；4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性，在90 ℃处理后，仍能保留60%以上的结合活性。 结论:通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体，为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

目的 制备羊种布鲁菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB5的单克隆抗体,为布鲁菌病的病原学诊断及研究提供基础.方法 将纯化的VirB5蛋白以60 μg/只的剂量对4只SPF级雌性BALB/c小鼠进行皮下注射免疫,以30 μg/只的剂量每2周加强免疫1次,共3次;2周后,取小鼠眼眶静脉血测定抗体效价,再经腹腔注射进行第4次加强免疫;3d后,取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞按5∶1的比例进行融合.对融合的细胞进行3次细胞筛选及单克隆化,建立稳定分泌VirB5抗体的杂交瘤细胞株;对1只BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞腹腔注射,待小鼠腹部明显膨大时收集腹水并进行抗体效价测定.单克隆抗体免疫学特性鉴定分别采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白免疫印迹法.结果 共建立6株能够分泌VirB5抗体的单克隆细胞株(2-2、2-12、2-19、2-25、2-31和2-40).其中,细胞株2-19能够稳定分泌特异性识别VirB5纯化蛋白的抗体,经鉴定其分泌的VirB5抗体为IgG1亚型、κ轻链,单抗亲和常数为1.6×108,且腹腔注射细胞株2-19的小鼠腹水抗体效价为1:51 200.结论 成功制备出布鲁菌Ⅳ型分泌系统蛋白VirB5的高亲和性单克隆抗体,抗体能够快速与病原菌表面蛋白特异性结合,为布鲁菌病病原学诊断方法的建立提供了一种备选材料.

目的 建立一种区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒感染株的双重荧光定量PCR方法.方法 分别以布鲁氏菌4型分泌系统中VirB8基因、VirB12基因序列设计2对引物及探针,优化实时荧光PCR反应体系及条件.以牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株、大肠杆菌、沙门氏菌基因组DNA进行Realtime-PCR扩增,评价该方法特异性.分别构建布鲁氏菌VirB12基因和VirB8基因片段阳性质粒,10倍系列稀释后进行Realtime-PCR扩增,测定该方法的敏感性.结果 本方法具有良好的特异性,牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌M5疫苗株以及猪种布鲁氏菌S2疫苗株基因组DNA同时出现VirB8基因与VirB12基因阳性扩增,牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株仅出现VirB8基因阳性扩增,大肠杆菌、沙门氏菌均未扩增出 目的条带,对VirB8基因及VirB12基因片段阳性质粒的检测限分别为约102copies/μL和103 copies/μL.该方法仅用于鉴别区分牛种布鲁氏菌A19-△VirB12标记疫苗株与布鲁氏菌野毒株.结论 本研究建立的布鲁氏菌双重Realtime-PCR方法,具有良好的特异性和敏感性,为今后鉴别牛种布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗免疫牛与 自然感染牛提供技术支撑.