目的 基于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)诱导表达系统制备呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial vi-rus,RSV)口服疫苗,并对其免疫原性进行分析.方法 将构建的质粒pUC57-Pre F与pNZ8149分别经Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,酶切产物经T4 DNA连接酶连接后获得重组质粒pNZ8149-Pre F,电转化至感受态L.lactis NZ3900,经乳糖培养基筛选获得非分泌型重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F,以nisin A为诱导剂诱导表达,经Western blot和免疫荧光标记对其表达产物进行分析;将雌性BALB/c小鼠随机分为PBS、L.lactis NZ3900/pNZ8149、L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组,15只/组,每只口服500 μL,于第1、2天进行初次免疫,第16、17天进行加强免疫,第14和28天经小鼠下颌取血并分离脾脏细胞,ELSIA法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的体液和黏膜免疫应答水平,ELISpot法检测重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F诱导的细胞免疫应答水平.结果 重组L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F经PCR及测序鉴定,证明构建正确;抗原蛋白Pre F特异性地表达在L.lactis NZ3900中,相对分子质量约 50 000;初次免疫后第 14 和 28天,与 PBS 和L.lactis NZ3900/pNZ8149组相比,L.lactis NZ3900/pNZ8149-Pre F组小鼠血清Pre F-特异性IgG抗体效价、肠洗液中特异性分泌型IgA抗体以及脾脏细胞中IFNγ和IL-4分泌水平均明显升高,且差异均有统计学意义(t=-30.268～-3.087,P均＜0.05).结论 基于L.lactis诱导表达系统构建的RSV 口服疫苗具有较强的免疫原性,为研发RSV黏膜疫苗提供了参考,也为开发其他病毒或细菌口服疫苗提供了新的研究策略及方法.

目的:探讨流式探针法在分析、分选丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)特异性B细胞以及全人源单克隆抗体发现中的作用。方法:采用伯胺标记法制备HCV特异性探针；使用流式细胞术检测和分选HCV特异B细胞，并体外通过单个B细胞抗体克隆技术从分选的HCV特异性B细胞中克隆表达抗体；应用ELISA技术和假病毒中和试验检测抗体的结合活性以及中和活性。结果:探针法能有效地检测HCV特异的记忆性B细胞，HCV患者探针阳性细胞频率明显高于正常人(U＝0.0004, P <0.0001)。通过单细胞分选HCV特异的记忆性B细胞，体外克隆表达获得6个单克隆抗体，其中有5个与HCV膜蛋白具有结合活性，2个显示具有较强中和活性。 结论:伯氨标记法制备HCV特异性探针是一种简单高效的探针制备方法，结合流式细胞术可用于HCV特异B细胞的检测以及分选。

当前，导致新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的2019新型冠状病毒感染已严重威胁到全球公共卫生。临床迫切需要及时诊断COVID-19以指导流行病学措施、感染控制、抗病毒治疗和疫苗研发。纳米生物传感器由于其器件体积小、免标记、特异性好、检测时间短等优点，已实现对多种生物标志物的高性能检测并有望在未来成为2019新型冠状病毒的床旁检测工具。因此，该文概述了纳米生物传感器的工作原理及分类，重点总结了近一年来所报道的纳米生物传感器在检测2019新型冠状病毒方面的研究进展。最后，该文简要展望了纳米生物传感器所面临的挑战和未来的发展前景。

目的:利用布鲁菌Omp31的单克隆抗体，初步建立布鲁菌抗原流式细胞术（FCM）检测方法，分析该方法在人布鲁菌病（简称布病）临床样本检测中的价值。方法:牛种布鲁菌2308、104M、S19，羊种布鲁菌M5-90和猪种布鲁菌S2共5个菌株，经超声破碎，获得其菌液上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和蛋白免疫印迹法（Western blot），检测已制备的抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3对上述5个菌株的识别能力。构建Omp31重组真核表达载体（pcDNA3.1-Omp31）并转染人胚肾细胞（293FT细胞），Western blot检测Omp31蛋白的表达。羊种布鲁菌弱毒疫苗株M5-90侵染人急性单核细胞白血病细胞系（THP-1细胞），构建含菌单核吞噬细胞。将5H3抗体用异硫氰酸荧光素（FITC）或藻红蛋白（PE）标记，采用FCM，利用FITC-5H3抗体检测pcDNA3.1-Omp31转染293FT细胞和含菌单核吞噬细胞，鉴定该抗体对细胞内布鲁菌抗原的识别能力，初步建立FCM的检测方法，并测定FITC-5H3抗体在FCM中的灵敏度。利用双抗体（PE-5H3和FITC-CD14）的流式细胞染色测定人外周血单个核细胞（PBMCs），分析该方法应用于人布病临床检测的可行性。结果:抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3不仅能识别羊种布鲁菌M5-90菌株和猪种布鲁菌S2菌株，还能识别缺失Omp31基因的牛种布鲁菌2308、104M、S19菌株。FITC-5H3抗体可用于流式细胞染色识别细胞内的布鲁菌抗原，表达Omp31的293FT阳性细胞比例约为59.3%，疫苗株M5-90侵染的THP-1阳性细胞比例约为6.2%，检测293FT阳性转染细胞的灵敏度为4%。初步建立了基于PE-5H3和FITC-CD14的双抗体染色的FCM检测方法，该方法检测布病患者PBMCs中的双抗体阳性细胞比例（1.93%）高于健康人群（< 0.30%，阴性）。结论:利用FCM，初步建立了荧光素标记抗布鲁菌Omp31单克隆抗体5H3检测细胞内布鲁菌抗原的方法，并发现5H3抗体能识别牛种布鲁菌，弥补了布鲁菌抗原检测中Omp31的应用缺陷。此方法的建立为布病病原学检测方法的研究提供了新策略，为检测试剂的开发提供了新材料。

评述了目前在全世界范围内被批准紧急使用的几种新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)疫苗的安全性、免疫原性和有效性，以及疫苗研发和接种可能面临的挑战。新冠肺炎疫苗采用的技术有基于mRNA，腺病毒载体的基因工程疫苗和传统的灭活病毒疫苗。疫苗的有效性从60%~95%左右。由于疫苗急迫的开发和匆促的批准使用，疫苗的安全性、保护作用持续的时间，免疫学机制，对病毒变异株感染的保护作用等都还需要更多的研究和观察。

目的:建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，验证其检测性能，为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法:小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水，Protein-A亲和层析纯化腹水抗体，SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度，间接ELISA法测定McAb效价，Western blot鉴定其特异性；叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后，通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度，建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准，验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度；通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果:4株McAb腹水效价均>1∶10 6，抗体纯度均>98%；经Western blot鉴定，1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白，2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应；经抗体配对筛选后，选择3A4为包被抗体，1D5为标记抗体；棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml，HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml；线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml， R2>0.99；专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性；抗原回收率在95.8%~108.7%之间，精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。 结论:成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法，为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中，SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。

病毒、细菌、真菌感染是威胁人类健康的三大"杀手"，其中新发病毒感染在近几年来呈现暴发的态势。病毒的早期检测对于病毒感染性疾病的及时诊断、有效治疗、疗效评估、感染机制研究以及疫苗研发至关重要。场效应晶体管（field effect transistor，FET）生物传感器因其免标记、检测成本低、灵敏度高、特异性好、检测速度快等特点而有望成为新型病毒床旁检测工具。本文综述了FET生物传感器的结构、检测原理及其应用于各种病毒检测的研究进展，旨在促进多学科交叉合作及病毒检测新平台的研发。

目的:分析贵州省2017-2019年H3N2亚型流感病毒HA基因特征，了解变异规律。方法:由贵州省10家网络实验室分离的H3N2亚型流感毒株中随机选取20株提取RNA，进行逆转录酶聚合酶链反应和测序，采用生物信息软件分析。结果:20株毒株HA基因核苷酸同源性为97.7%~100.0%，与世界卫生组织推荐的疫苗株A/Hong-Kong/4801/2014（2017年）和A/Singapore-INFIMH/16-0019/2016（2018年）同源性高，而与2019年世界卫生组织推荐的疫苗株A/Kansas/14/2017（2019年）差异较大。遗传分析显示，20株病毒株主要分为2个分支，2019年流行的毒株处于不同的分支，遗传差距较大。关键位点分析显示，抗原决定族A、B、C和E存在突变；受体结合位点前壁和后壁存在突变；与当年度疫苗株相比，存在糖基化位点的增加。2017-2018年毒株在遗传距离、抗原位点和糖基化位点变异情况与2019年毒株略有不同。结论:贵州省2017-2019年H3N2亚型流感病毒HA基因发生基因突变，2019年的毒株变异最为严重，应密切监测H3N2亚型流感病毒遗传进化的变化情况。

目的:研制新型非天然氨基酸标记的HiD-Hin47融合载体蛋白。方法:选择融合蛋白氨基酸序列中合适位置的20个氨基酸位点，利用非天然氨基酸标记技术将原有氨基酸位置插入一种含叠氮基的非天然氨基酸N6-(2-叠氮乙氧羰基)-L-赖氨酸(NAEK)，对不同位点插入NAEK的融合蛋白进行表达和纯化，纯化后产物经SDS-PAGE分析，观察各位点融合蛋白产量，最终E677位点表达稳定性更高，均能达到野生型的70%，选择E677位点表达的融合蛋白与3型和6B型肺炎球菌多糖发生click反应完成偶联，所得结合物纯化后进行动物实验和免疫学检测，并与CRM197、破伤风类毒素(TT)、HiD以常规结合方式与3型和6B型肺炎球菌多糖结合产物进行对比。结果:以HiD-Hin47为载体蛋白的3型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性稍优于与其余3组结合物，但差异无统计学意义；以HiD-Hin47为载体蛋白的6B型肺炎球菌多糖结合物的免疫原性显著优于以TT、HiD为载体的结合物，与以CRM197为载体结合物的免疫原性差异无统计学意义。结论:NAEK标记的HiD-Hin47具有作为肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗载体蛋白的潜力，值得进行进一步研究。

目的 建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)融合前F蛋白(prefusion F protein,pre-F)三聚体定量检测方法,并对其进行方法学验证和初步应用.方法 选取RSV pre-F三聚体特异性抗体AM14 作为捕获抗体,辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的RSV pre-F特异性抗体D25 作为检测抗体,通过方阵滴定法确定捕获抗体和检测抗体的最佳浓度,对封闭液进行优化,建立双抗体夹心ELISA.分别对该方法的专属性、准确度、精密度和耐用性进行验证,并应用于RSV亚单位疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测.结果 该方法确定的捕获抗体AM14 包被浓度为 1.25 μg/mL,检测抗体D25 浓度为0.50 μg/mL,封闭液为1%牛血清白蛋白(bo-vine serum albumin,BSA).方法验证结果显示,线性范围为 1.50～24.00 ng/mL,标准曲线R2>0.99,最低检测限可达1.33 ng/mL;该方法专属性良好,仅与RSV pre-F三聚体反应;准确度和精密度验证结果显示回收率为 87.41%～117.03%,变异系数(coefficient of variation,CV)为 5.47%～14.07%;检测抗体孵育时间及显色时间在一定范围内波动时,回收率在 87.65%～106.45%,证明该方法耐用性优良;该方法可应用于RSV pre-F发酵和纯化等样品的检测.结论 成功建立并验证RSV pre-F三聚体定量检测方法,该方法专属性强,准确度、精密度、耐用性均优良,可应用于RSV疫苗工艺开发中pre-F三聚体的定量检测,无需Octet或者Biacore等精密仪器,具有操作简单、定量准确、成本低、便于推广应用等优点.