目的:制备人乳头瘤病毒6型L1(HPV6 L1)蛋白特异性单克隆抗体，探索抗体的结合特点、交叉活性以及中和效果。方法:从免疫HPV6 L1蛋白小鼠脾细胞中提取抗体基因，构建ScFv噬菌体抗体文库。用HPV6 L1蛋白对文库进行富集筛选，将获得的抗体基因表达成鼠IgG后，验证抗体与L1蛋白的结合性质以及对假病毒的中和效果。结果:成功构建了针对HPV6 L1的ScFv抗体文库，库容量为6.54×10 7。抗体文库经HPV6 L1筛选后获得了两株抗体，命名为Q9和Q11。经ELISA检测，Q9-IgG与HPV6 L1反应的滴度约为10 6，与HPV18和45 L1的滴度为10 2。Q11-IgG与HPV6 L1结合的滴度约为4×10 4，而与其他型别L1均不结合。经过假病毒中和试验测定，Q9-IgG没有中和活性，而Q11-IgG针对HVP6假病毒的中和滴度约为10 4.5。 结论:Q9和Q11均为HPV6 L1特异性单克隆抗体，但二者交叉反应性、抗原识别位点及中和活性均具有明显差异。该抗体可为HPV6病毒的基础研究、免疫学诊断以及治疗制剂研发提供工具抗体。

目的:制备能与VirB12抗原高亲和力结合的新疆双峰驼纳米抗体，为后续研究奠定基础。方法:采用VirB12重组蛋白6次免疫新疆双峰驼，从外周血中分离得到淋巴细胞后提取总RNA，通过巢式PCR扩增VHH基因片段构建噬菌体VHH展示文库。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）固相亲和富集方法进行筛选。进行3轮亲和筛选后随机挑取出第2、3轮富集的克隆，ELISA分析可溶性表达的纳米抗体与VirB12蛋白的结合情况。经过序列测定和多重比对去除重复序列，最后得到个5非冗余序列，分别命名为D1、E6、H8、H9和H10。将筛选鉴定的5个纳米抗体基因转化WK6菌株，在16 ℃下进行胞间质可溶性表达，经Ni亲和柱纯化表达后，Western Blot和ELISA法检测纳米抗体与VirB12抗原的结合能力与热稳定性。结果:经VirB12蛋白免疫后的血清抗体效价最少为1∶24 000。从VirB12抗原免疫的新疆双峰驼淋巴细胞中获得了滴度为2.8×10 8 cfu/ml的VHH噬菌体展示文库。5株纳米抗体在WK6菌中以可溶形式表达。结果表明，5株抗VirB12纳米抗体质量分数接近90%，且具有较高的抗原结合活性与明显的抗原-抗体浓度相关性；4株纳米抗体均表现出较高的热稳定性，在90 ℃处理后，仍能保留60%以上的结合活性。 结论:通过固相筛选富集和可溶性单克隆检测鉴定获得了5株具有较高亲和力和热稳定性的抗VirB12纳米抗体，为VirB12纳米抗体的进一步开发奠定了基础。

新型冠状病毒肺炎在全球范围内广泛传播，对公众健康构成严重威胁。快速有效的检测手段对疫情监测与控制具有重要的意义。噬菌体抗体库是基于噬菌体展示技术发展起来的抗体文库，包含数以亿计的抗体变体，能够筛选出高特异性、高亲和力的抗体，已在多个领域中得到广泛应用，对于开发抗原检测试剂以及抗体治疗药物具有重要意义。本文对噬菌体展示技术及其在新型冠状病毒（SARS-CoV-2）检测与新型冠状病毒肺炎防治中的研究进展进行综述，为开发新型试剂、优化检测方法提供参考。

蛇毒已被证明具有抗炎活性,其中包含许多免疫原性弱、活性强的短肽小分子.蛇毒腺是分泌毒液的器官,含有毒素成分及调控其分泌过程的大量生物活性成分.缓激肽2型受体(B2R)参与重要的细胞内信号通路,作为炎症的调节因子成为潜在的抗炎药物开发的靶点.为了获得特异性的B2R结合肽,利用尖吻蝮蛇Deinagkistro-don acutus毒腺T7噬菌体文库对靶点B2R进行3轮生物淘选,测序获得了多个具有潜在结合能力的序列.通过序列长度、溶解性预测、稳定性预测和分子对接等一系列生物信息学分析,最终确定1个含25个氨基酸的肽段,命名为DAvp-4.合成该肽段,通过表面等离子体共振技术验证了DAvp-4和B2R的结合能力,在脂多糖诱导的巨噬细胞模型及糖尿病视网膜病变小鼠模型中肯定了其抗炎作用.此研究不但获得了一个具有成药潜力的毒腺多肽,还显示了噬菌体展示技术在筛选天然产物成分研究中的有效性.

目的:产KPC-2型肺炎克雷伯菌可引起β-内酰胺类抗生素、碳青霉烯类抗生素产生耐药性.通过噬菌体展示技术从抗KPC-2纳米抗体文库中筛选与KPC-2特异性结合的纳米抗体,为产KPC-2型肺炎克雷伯菌耐药性的检测和诊断提供技术支持.方法:利用重组KPC-2免疫双峰骆驼,从骆驼的外周血淋巴细胞中提取RNA,逆转录为cDNA,通过两轮嵌套式PCR扩增出纳米抗体片段,构建抗体文库,并通过噬菌体展示技术筛选特异性纳米抗体.通过HPLC和OCTET分别进行表位分析和亲和力测定.结果:构建了一个库容为5.47×108 cfu/ml且插入有效片段不低于81.25%的纳米抗体文库;并建立抗KPC-2纳米抗体的免疫淘选方法;获得了2个不同CDR3区的纳米抗体K2和K5,亲和力分别为6.0 nmol/L和4.8 nmol/L.且在KPC-2上具有2个非竞争性结合表位.结论:成功淘选出2个不同表位的特异性纳米抗体,有望替代传统抗体用于肺炎克雷伯菌耐药性疾病的检测和诊断.

目的 利用噬菌体展示技术及重组抗体构建技术筛选出特异性醛固酮(ALD)抗体,为ALD诊断试剂盒的研发提供原材料.方法 取5只健康清洁级新西兰大白兔,将抗原ALD-血蓝蛋白(KLH)稀释至2 mg·L-1,采用背部多点注射方法对5只新西兰大白兔进行首次免疫,免疫剂量为每只1 mg;每隔2周进行1次免疫,且免疫剂量减少50％;从第3次免疫开始,每次免疫1周后采集大白兔耳缘静脉血,使用包被0.25 mg·L-1ALD-BSA抗原的化学发光板,采用间接法和竞争法测定血清滴度;第5次免疫后选取血清效价高、特异性好的大白兔,取其脾脏和骨髓等组织.将脾脏组织研磨,采用TRIzol试剂一步法提取RNA,获取轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因序列.通过连接肽连接成单链片段(ScFv)并构建至噬菌粒载体Pcomb3xss中;然后,通过电转化方法将其导人大肠杆菌TG1,完成ALD ScFv噬菌体展示库构建.对文库进行3～5轮富集筛选,并挑取单克隆进行噬菌体上清制备,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)竞争法鉴定后送测,获得高竞争性克隆序列;将筛选得到的克隆序列插入至pCMV3表达载体,提取质粒后使用瞬时转染方法进行HEK293细胞转染;1周后,收取上清,应用亲和层析纯化及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳鉴定其纯度及表达量.结果 5只大白兔在第5次免疫后,间接法检测其血清效价结果显示,4#、5#大白兔血清在稀释32 000倍后,效价仍＞10 000.竞争法检测结果显示,5#大白兔血浆样本低值与高值的比值为2:1,优于其他大白兔.选取5#大白兔进行噬菌体文库构建.使用常规聚合酶链反应扩增出VL及VH基因片段,经搭桥拼接成ScFv(VL+VH)后,琼脂凝胶电泳分析可看到750 bp左右大小条带,与最初设计的片段大小一致.ScFv经酶切连接电转至大肠杆菌TG1中,构建一个库容为4.73 ×108 cfu·mL-1的噬菌体文库.经3轮淘洗出库平皿挑取300个单克隆,制备单克隆噬菌体,ELISA结果显示,300个克隆中阳性率达100％,校准品竞争检测阳性克隆42个,筛出率14％;42个阳性克隆进一步进行临床样本竞争检测,筛出16株单克隆符合要求,将16株进行复测,2次检测结果一致;测序后优选6条抗体序列进行构建表达,纯化后SDS-PAGE还原胶电泳结果显示,在重链50 000及轻链25 000位置均有条带,获得6株高亲和力、竞争性的兔ALD单抗.结论 通过噬菌体展示技术成功筛选出6株高亲和力、竞争性的兔ALD抗体,这为小分子抗体的发现提供了一种参考方法.筛选出的AD185、AD277抗体在校准品及临床样本竞争中,均表现出比阳性对照高出2倍的竞争优势,这为ALD检测试剂盒原材料的开发提供了可能性.

目的 筛选抗低钙应答V抗原(LcrV)的人源单克隆抗体,分析抗体基因特点,检测抗体与抗原结合的特异性、亲和力及功能.方法 使用PCR方法从鼠疫疫苗临床试验志愿者外周血细胞cDNA扩增抗体轻、重链可变区基因片段,构建ScFv噬菌体抗体文库.用LcrV对文库进行富集筛选,将获得的抗体基因表达成人IgG1后,测定抗体与LcrV抗原结合的特异性、亲和力、免疫调节功能以及保护能力.结果 成功构建了鼠疫耶尔森菌人源ScFv抗体文库,库容量为7.54× 108.抗体文库经LcrV筛选后获得了 3株抗LcrV抗体,命名为RV-B4、RV-D1和RV-E8.3株抗体重链为VH1-46和VH3-30,轻链分别为VL1-51、VK3-20和VK1-39.3株抗体经ELISA及Western blot验证均与LcrV特异性结合,其与V抗原结合的解离常数(KD)分别为2.1 nmol/L、1.24 nmol/L和42 nmol/L.RV-D1体外降低人THP-1分泌TNF-α,动物攻毒试验中未发现抗LcrV抗体的保护效果.结论 从鼠疫疫苗免疫人群获得了靶向低钙应答V抗原的人源抗体,以结合抗体为主,不能有效阻断病菌感染.所获得的单抗为鼠疫免疫基础研究、鼠疫诊断应用提供了候选材料.

目的 建立淋巴细胞激活基因3(LAG-3)免疫噬菌体纳米抗体文库,获得高特异性和亲和力的抗LAG-3纳米抗体,并鉴定其功能活性.方法 采用人LAG-3蛋白免疫羊驼,获取外周血cDNA;通过巢式PCR获得纳米抗体基因,构建至pComb3XSS质粒,电转至大肠杆菌XL1-Blue中构建纳米抗体噬菌体免疫文库,并对文库进行质量分析.通过噬菌体展示技术筛选抗LAG-3特异性纳米抗体,通过第二代基因测序技术获得纳米抗体的基因序列.将目的序列构建到大肠杆菌BL21(DE3)周质表达载体pET-22b(+)中进行抗体表达,Prism A柱进行纯化,通过高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS)、ELISA、Western blot法和表面等离子共振技术(SPR)进行抗体性质和功能分析.结果 构建的纳米抗体噬菌体免疫文库的库容为7.20 ×108菌落形成单位(CFU),序列分析文库多样性良好,经过4轮淘筛后获得3条具有不同氨基酸序列的抗LAG-3纳米抗体,分别为重链抗体重链可变区结构域-L1-3(VHH-L1-3)、VHH-L3-2和VHH-L13-2,纳米抗体表达纯化后纯度在95％以上,三种抗体均可以与重组人LAG-3蛋白进行特异性结合;其中VHH-L13-2抗体的亲和力指数KD值为3.971 × 10 mol/L,且对于LAG-3和纤维蛋白原样蛋白1(FGL-1)的结合具有抑制作用,半数抑制浓度(IC50)值为15.58 nmol/L.结论 成功构建了 LAG-3纳米抗体噬菌体免疫文库,筛选获得了特异性好、亲和力高的LAG-3纳米抗体,且对于LAG-3与其配体的结合具有一定的抑制作用.

文章首先采用细胞表达抑制状态的代谢型谷氨酸受体 5(Metabotropic glutamate receptor 5,mGluR5)蛋白免疫野生双峰驼,构建纳米抗体文库,运用M13 噬菌体展示技术,筛选出与mGluR5具有特异性结合的纳米抗体;其次用细胞对mGluR5蛋白进行表达纯化,然后对野生单峰驼进行 7次免疫,对抽取骆驼的外淋巴细胞总RNA进行提取,经过反转录的方式转为cDNA,将用巢式PCR对VHH片段进行扩增并与pMECS噬菌粒载体进行连接,并电转化至TG1大肠杆菌中构建纳米抗体噬菌体展示文库;其三通过M13噬菌体展示技术对文库进行淘选,淘选出多个互补决定区 3 序列不同的纳米抗体;最后纯化出纯度较高的mGluR5 蛋白,构建出库容量为 5.47×108CFU/mL的噬菌体文库菌,经过两轮液相淘选,获得了12个互补决定区3 序列不同的纳米抗体.研究成功筛选出12 个与mGluR5特异性结合较高的纳米抗体,为mGluR5 的靶向药物研发和G蛋白偶联受体的信号通路研究奠定了基础.

使用全人源噬菌体单链抗体文库进行筛选,获得特异性靶向磷脂酰肌醇聚糖-3 (GPC3)的单链抗体,并对单链抗体的生物学活性和抗原表位进行鉴定.经过4轮“结合-淘洗-洗脱-扩增”后,利用噬菌体ELISA和IMGT数据库分析抗体序列的靶向性和完整性.单链抗体的基因序列与表达载体pET-22b进行双酶切并连接,重组载体转化大肠杆菌E.coli Rosetta (DE3),抗体表达后经Ni2+柱亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot对单链抗体分子质量进行鉴定.抗体对抗原的亲和力常数通过ELISA和SPR实验获得,流式细胞术分析其与细胞膜受体的结合能力.经筛选获得4个单链抗体(1F7、1D7、1D4和1B10)具有良好的靶向性和亲和力,其中1F7单链抗体的亲和力和结合能力最高.本课题抗GPC3单链抗体为双特性抗体和免疫毒素等新一类免疫治疗药物的开发奠定基础.