目的:分离培养WU多瘤病毒(WU polyomavirus，WUPyV)并分析全基因组系统进化、同源性及种群动态特征。方法:采用实时荧光定量PCR检测2020—2022年间北京友谊医院呼吸道感染住院患儿鼻咽抽吸物样本，利用气液两相的原代人呼吸道上皮细胞模型对WUPyV阳性样本进行病毒分离培养，Sanger测序获得全基因组，结合GenBank数据库中已公布的全基因组信息进行系统发育和进化动力学研究。结果:WUPyV在2020—2022年的检出率为4.7%(31/659)，并成功分离1株Ⅲc型WUPyV临床病毒株BJ0593。WUPyV全基因组及各基因片段同源性较高，VP2基因的平均进化速率约为每年1.256×10 －4个氨基酸替换/位点，种群动态在近十年内趋于平缓。 结论:本研究首次成功分离Ⅲ型WUPyV临床病毒株，为WUPyV的分子进化及致病性研究提供基础。

1 KIPyV和WUPyV的发现2007年,瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院的科学家Allander等[1]运用大规模分子筛技术从637份小儿下呼吸道感染分泌物和192份粪便中检测出一种新的人类多瘤病毒,并以发现者单位(Karolinska Institutet)命名为“KI多瘤病毒(KI polyomaviruses,KIPyV)”.同年5月,美国华盛顿大学医学院的Gaynor和澳大利亚皇家儿童医院的Nissen等科学家利用分子病毒筛查法从一名患有肺炎的3岁澳大利亚儿童的下呼吸道分泌物中检测到一种新病毒.在完成了该病毒的全基因组测序后,鉴定为另一种新的人类多瘤病毒,并以发现者单位(Washington University)命名为“WU多瘤病毒(WUDolvomaviruses,WUPyV)”.

WU/KI多瘤病毒于2007年首次在呼吸道分泌物中发现后,世界各地相继有检出阳性的报道,近年来我国浙江、深圳等地区亦有检出,但是国内关于这两种病毒的研究不多.WU/KI多瘤病毒均属于多瘤病毒属,感染多发生在儿童早期,其季节分布各地报道不一,临床多表现为发热、咳嗽、喘息等呼吸道症状,无特异性,且常同其他呼吸道病毒混合感染.WU/KI多瘤病毒在免疫缺陷患者中感染率较高,HIV患者感染后可能会导致重症疾病,但对于两种多瘤病毒的发病机制、致病特点等目前尚不清楚,故其是否是呼吸道致病原还存有争议.

目的 调查国内儿童急性呼吸道和消化道感染中是否存在脑心肌炎病毒(EMCV)感染.方法 对2013年1月至12月天津市儿童医院收集的577份急性呼吸道感染患儿鼻咽抽吸物和384份消化道感染患儿粪便标本,以针对EMCV 5'-UTR基因序列设计的特异性引物进行荧光定量PCR扩增,随机挑选阳性扩增产物进行核苷酸序列测定,并将所测序列在GenBank中进行比对.同时对所有标本进行其他多种呼吸道、消化道相关病毒检测.采用直接免疫荧光测定法检测7种常见呼吸道病毒;金标法检测轮状病毒、腺病毒;酶标法检测星状病毒;PCR方法检测鼻病毒、多瘤病毒WU、多瘤病毒KI、人博卡病毒、诺如病毒、肠道病毒、Aichi病毒及双埃可病毒;实时荧光定量PCR法检测心病毒.结果 577份鼻咽抽吸物标本检测出7例EMCV阳性,阳性率为1.2％.患儿年龄均在6个月以内,检出季节为秋季和冬季;384份粪便标本检测出11例EMCV阳性,阳性率为2.9％.患儿集中在1岁以内及4～7岁,除春季外,其他3个季节均有检出.阳性患儿呼吸道及胃肠道症状以发热、腹泻为主,与其他呼吸道及肠道病毒感染类似.88.9％(16/18例)的患儿居住在郊县和农村.其中5例样本存在与合胞病毒、腺病毒、心病毒和诺如病毒的混合感染.混合感染患儿性别、年龄、住院时间、病情严重程度与单纯EMCV感染患儿相比,均无明显差异.结论 中国儿童存在EMCV感染,与呼吸道和消化道感染相关,需进一步检查其他感染是否与EMCV有关.

目的 了解儿科重症监护室中喘息性疾病的病毒性病原谱.方法 收集2010年6月至2011年12月因喘息性疾病入住汕头大学医学院第二附属医院儿科重症监护室患儿咽拭子标本70份.应用多重PCR技术对呼吸道病毒进行检测,并分析阳性病例的临床资料.结果 70份咽拭子标本中,呼吸道病毒检测阳性54例(77％),其中单独病毒阳性34例,混合感染20例.病毒检测阳性标本中,最常见的是呼吸道合胞病毒(RSV)23份,其次分别是人鼻病毒(HRV)21份,腺病毒8份,人博卡病毒4份,副流感病毒3型4份,副流感病毒4型3份,人偏肺病毒、WU多瘤病毒、季节性流感H1N1和新型甲型流感H1N1各1份;混合感染中19份为2种病毒混合,1份为3种病毒混合;混合检出最多的病毒是RSV混合HRV(6份).病毒检测阳性标本中,临床诊断39例喘息性肺炎,11例毛细支气管炎,3例喘息性支气管炎和1例支气管哮喘持续状态.结论 本地区儿科重症监护室中喘息性疾病的病原体中病毒性病原体检出率高,以RSV和HRV最常见.

自2007年GaynorA M等人通过高通量测序在肺炎患儿呼吸道样本中发现了WU多瘤病毒(Washington University polyomavirus,WUPyV)以来,WUPyV在世界各地被广泛检出.为了解北京地区急性呼吸道感染住院儿童中WUPyV感染情况及其临床特征,收集北京地区2017年4月至2018年3月共1 276份呼吸道感染住院患儿的鼻咽抽吸物样本,使用real time PCR方法对样本进行WUPyV检测,同时对WUPyV阳性样本进行17种常见呼吸道病毒筛查.共检出WUPyV阳性样本76份(5.96％,76/1276),4岁以下儿童居多(92.11％,70/76);WUPyV感染全年可见,无显著季节性;多伴随其他呼吸道病毒混合感染(60.53％,46/76),最常见混合感染为鼻病毒和A型流感病毒;WUPyV单一感染者与混合感染者病毒载量无显著性差异,临床诊断和表现基本一致;WUPyV感染患儿的常见诊断为支气管炎(68.42％,52/76)和肺炎(30.26％,23/76);临床症状主要表现为高热、咳嗽、咳痰.研究结果提示WUPyV是北京地区急性呼吸道感染住院患儿呼吸道样本中常见病毒之一,多见于4岁以下儿童.

目的 制备抗重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)多克隆抗体和抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)单克隆抗体,建立针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,并对该方法进行验证.方法 将SARS-CoV-2灭活病毒纯化抗原免疫日本大耳白兔制备兔多克隆抗体;免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株,经蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)和间接ELISA法筛选获得抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体.采用过碘酸钠氧化法对单克隆抗体5E11进行标记,偶联HRP分子,用方阵滴定法对包被抗体(50～800 ng/孔)和酶标抗体(1 ∶500～1 ∶8 000)的工作浓度进行优化,建立SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,确定方法线性范围和最低检测限,并对其准确度、精密度、耐用性、特异性进行验证.用建立的方法检测3批SARS-CoV-2灭活疫苗工艺过程阶段样品中N蛋白抗原含量.结果 选择高效价的SARS-CoV-2兔抗血清纯化后的多克隆抗体作为包被抗体,特异性强的单克隆抗体5E11作为酶标抗体,包被抗体最佳工作浓度为100 ng/孔,酶标抗体最佳工作浓度为1 ∶1 000,建立了针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法.该方法在1.6～200 WU/mL范围内,抗原含量与对应的A450/A630呈良好的线性关系,R2＞0.99,最低检出限为1.6 WU/mL;高、中、低(100、50、25 WU/mL)浓度SARS-CoV-2内部参考品检测均值回收率分别为104.33％、101.33％和98.67％,CV 分别为7.06％、7.47％和12.39％;重复性验证CV为8.54％,中间精密度验证CV为8.37％;耐用性验证回收率在88％～112％之间;该方法可特异性识别SARS-CoV-2全病毒Virion、重组N蛋白,与其他抗原均无交叉反应.结论 成功建立了 SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,该方法具有良好的线性相关性,准确度、精密度、特异性良好,可用于SARS-CoV-2灭活疫苗中N蛋白抗原含量的检测.