目的:筛选含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1(WWP1)相互作用蛋白，探讨WWP1和依托泊苷诱导蛋白24(EI24)对肝癌细胞增殖的影响。方法:利用酵母双杂交的方法筛选与WWP1相互作用的蛋白，并利用免疫共沉淀来进行相互作用验证。通过体内泛素化实验验证泛素连接酶WWP1与EI24酶和底物的关系。以慢病毒感染的方法建立WWP1和EI24稳定过表达或敲低表达的肝癌细胞系。通过细胞增殖实验、平板克隆实验和裸鼠成瘤实验检测WWP1和EI24对肝癌细胞增殖的影响。结果:WWP1可以与底物EI24相互作用，并能够在体内将EI24泛素化降解。成功构建稳定过表达或敲低表达的WWP1和EI24的肝癌细胞系HepG2。在HepG2细胞中，过表达WWP1可以降低内源EI24的蛋白水平，而敲低WWP1可以使EI24蛋白水平增加。细胞计数盒8(CCK-8)法检测结果表明，在36 h时，WWP1过表达组和shWWP1组细胞的相对增殖活性分别为(347.00±8.15)%和(187.08±4.86)%，与对照组(270.33±15.01)%比较，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。在36 h时，EI24过表达组和shEI24组细胞的增殖活性分别为(183.75±8.11)%和(317.33±9.60)%，与对照组(270.33±15.01)%比较，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。克隆形成实验结果显示，对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的克隆形成数分别为(52±7)个/视野、(76±4)个/视野和(19±3)个/视野，WWP1过表达组细胞克隆形成明显增多( P<0.05)，而敲低WWP1后细胞克隆形成较对照组减少( P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的克隆形成数分别为(38±4)个/视野、(10±3)个/视野和(69±7)个/视野。与对照组比较，过表达EI24使细胞克隆形成明显减少( P<0.05)，敲低EI24的表达使细胞克隆形成明显增多( P<0.05)。裸鼠体内实验结果显示，经过4周同等条件喂养后，对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 400.00±43.71)mm 3、(2 636.67±290.45)mm 3和(642.17±36.00)mm 3，差异均有统计学意义( P<0.05)。对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.23±0.08)g、(2.05±0.17)g和(0.88±0.09)g，差异均有统计学意义( P<0.05)。WWP1过表达组细胞成瘤能力明显增强，shWWP1组成瘤能力明显减弱。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1 245.17±93.10)mm 3、(662.17±60.88)mm 3和(1 986.67±226.75)mm 3，差异有统计学意义( P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.15±0.04) g、(0.85±0.02)g和(1.73±0.05)g，差异有统计学意义( P<0.05)。EI24过表达组细胞成瘤能力明显减弱，shEI24组成瘤能力明显增强。 结论:WWP1可以靶向底物EI24进行泛素化降解，并促进肝癌细胞的增殖。

目的 探讨WW结构域E3 泛素蛋白连接酶1(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1,WWP1)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白 3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)在射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)患者血清中的表达水平及临床意义.方法 选取华北医疗健康集团峰峰总医院 2021 年 1 月～2022 年 9 月收治的 153 例HFpEF患者为观察组,并根据患者纽约心脏病协会(New York Heart Association,NYHA)心功能分级分为心功能分级Ⅰ～Ⅱ级组(n=64)和心功能分级Ⅲ～Ⅳ级组(n=89),另选取同期体检健康的 148 例志愿者为对照组.血清WWP1,NLRP3 水平与患者心功能指标的相关性采用Pearson分析;受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清WWP1 和NLRP3水平对HFpEF患者心衰严重程度的诊断价值.结果 与对照组比较,观察组血清WWP1(1.68±0.35 vs 1.04±0.19)和NLRP3(6.72±1.26 ng/ml vs 4.57±0.84 ng/ml)表达水平明显升高,差异具有统计学意义(t=19.623,17.359,均P＜0.05);与心功能分级Ⅰ～Ⅱ级组比较,心功能分级Ⅲ～Ⅳ级组血清WWP1(1.87±0.39 vs 1.42±0.32)和NLRP3(7.53±1.40 ng/ml vs 5.59±1.18 ng/ml)表达水平明显升高,差异具有统计学意义(t=7.744,9.017,均P＜0.05);心功能分级Ⅰ～Ⅱ级组与心功能分级Ⅲ～Ⅳ级组心率、左心房内径(left atrial diameter,LAD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室舒张末期后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness,LVPWT)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、二尖瓣舒张早期流速峰值(peak mitral early diastolic velocity,E)/舒张晚期流速峰值(peak late diastolic velocity,A)以及心房颤动发生率比较差异均具有统计学意义(t/χ2=2.757～7.069,均P＜0.05);HFpEF患者血清WWP1 水平与LAD,LVEDD,LVPWT呈正相关(r=0.547,0.471,0.536,均P＜0.05),与LVEF和E/A呈负相关(r=-0.485,-0.417,均P＜0.05);血清NLRP3 水平与LAD,LVEDD,LVPWT呈正相关(r=0.534,0.494,0.520,均P＜0.05),与LVEF和E/A呈负相关(r=-0.462,-0.523,均P＜0.05).ROC结果显示,血清WWP1 和NLRP3 水平单独诊断HFpEF患者心衰严重程度的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为 0.825 和 0.855,两者联合诊断的AUC(0.924)显著大于血清WWP1 和NLRP3 水平单独诊断的AUC(Z=3.600,P<0.001;Z=3.053,P=0.002).结论 血清WWP1 和NLRP3 水平在HFpEF患者中明显升高,且与患者心功能密切相关,血清WWP1和NLRP3 对HFpEF患者心衰严重程度具有一定的诊断价值.

目的:探讨C-myc是否参与肝肿瘤HepG2细胞内蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)对第10号染色体同源丢失性磷酸酶基因和张力蛋白(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)表达的调控.方法:HepG2细胞经不同浓度的AKT抑制剂Capivasertib(5、10及20nmol/L)处理后,采用蛋白质印迹法检测AKT、C-myc和Bad及其磷酸化蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR法检测对C-myc下游真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E,eIF-4E)、支链氨基酸氨基转移酶1(branched-chain amino acid aminotransferase 1,BCAT1)及WW结构域E3泛素连接酶1(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1,WWP1)基因转录活性的影响.采用siRNA法沉默HepG2细胞中eIF-4E、BCAT1及WWP1基因的表达,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测沉默eIF-4E、BCAT1及WWP1基因表达对PTEN转录和蛋白表达水平的影响;细胞荧光免疫法检测Capivasertib或沉默WWP1基因表达对PTEN在HepG-2细胞中表达和定位的影响.结果:HepG2细胞经不同浓度的Capivasertib处理8h后,磷酸化-AKT(phospho-AKT,p-AKT)、p-C-myc和p-Bad蛋白的表达水平均较对照组明显下调(P值均＜ 0.01),C-myc调控的下游基因eIF-4E、BCAT1及WWP1 mRNA的表达水平均明显下调(P值均＜0.01).沉默eIF-4E、BCAT1及WWP1基因表达,对PTEN mRNA的表达均没有明显影响(P值均＞ 0.05),但沉默WWP1基因表达可使PTEN蛋白的表达水平明显上调(P＜0.01).细胞荧光免疫实验进一步证实,沉默WWP1基因表达与Capivasertib作用均可增强PTEN在HepG2细胞中的表达水平并使其在细胞膜上聚集.结论:AKT能通过C-myc信号途径影响WWP1基因的转录水平,进而实现对HepG2细胞中PTEN表达的调控.

目的 探讨微小RNA-497-5p(miR-497-5p)是否通过靶向含有WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)调控人瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖和凋亡.方法 实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)测定瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)和正常皮肤成纤维细胞(NFB)中miR-497-5p、WWP1 mRNA和蛋白表达.TargetScan预测miR-497-5p和WWP1的靶向关系,双荧光素酶报告和Western blot进一步验证.构建miR-497-5p过表达或抑制WWP1表达的细胞,Western blot检测WWP1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡.共转染miR-497-5p和pcDNA-WWP1,观察WWP1过表达对miR-497-5p过表达诱导的KFB细胞增殖和凋亡的影响.结果与NFB相比,KFB内miR-497-5p表达量明显下调(P<0.05),WWP1 mRNA和蛋白表达量显著上调(P<0.05).miR-497-5p靶向调控WWP1的表达.miR-497-5p过表达明显降低KFB 48h、72h的细胞活性、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达,提高细胞凋亡率、p21、Bax蛋白水平(P<0.05),与抑制WWP1表达结果相同.WWP1过表达逆转了miR-497-5p过表达对KFB增殖、WWP1、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达的抑制作用,以及对细胞凋亡、p21、Bax蛋白表达的促进作用.结论 过表达 miR-497-5p 通过靶向调控 WWP1 抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,并诱导其凋亡.

目的 探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响.方法 通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2.通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响.通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶.结果 在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显.在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用.溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低.放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05).WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰.结论 WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达.

目的 检测肺癌细胞中WW结构域E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和人第10号染色体缺失的磷酸酶(PTEN)表达,并探讨敲低WWP1表达对肺癌SPC-A1细胞增殖和侵袭能力影响机制.方法 利用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测肺癌细胞SPC-A1、H1299及正常肺上皮细胞BEAS-2B中WWP1和PTEN表达;WWP1 siRNA转染SPC-A1肺癌细胞以敲低WWP1表达,分为si-NC组,siWWP1#1组及siWWP1#2组,利用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞WWP1和PTEN表达,通过Transwell法检测肺癌细胞迁移和侵袭,细胞计数试剂(CCK-8)法检测细胞增殖.结果 在正常肺上皮细胞BEAS-2B,肺癌细胞SPC-A1和H1299中WWP1 mRNA相对表达量分别为1.00士0.08、3.10±0.24和2.30±0.20,差异有统计学意义,F=93.960,P＜0.001;PTEN表达量分别为1.00土0.10、0.34土0.04和0.53±0.04,差异有统计学意义,F=91.940,P＜0.001;与正常细胞株相比,WWP1在肺癌细胞株中表达增加,而PTEN表达则降低.WWP1和PTEN蛋白检测结果与qRT-PCR检测结果一致.敲低WWP1后,si-NC组、siWWP1#1组和siW-WP1#2组WWP1 mRNA相对表达量分别为1.00±0.09、0.32±0.03和0.27±0.03,差异有统计学意义,F=151.200,P＜0.001;PTEN表达量分别为1.00±0.07、2.81±0.21和3.34±0.33,差异有统计学意义,F=85.810,P＜0.001,与si-NC组相比,WWP1在siWWP1#1组,siWWP1#2组表达降低,而PTEN表达则增加.WWP1和PTEN蛋白检测结果与qRT-PCR检测结果一致.Transwell迁移结果显示,si-NC组、siWWP1#1组和siWWP1#2组细胞迁移数目分别为(126土9)、(44±4)和(50±4)个,差异有统计学意义,F=166.400,P＜0.001;Transwell侵袭结果显示,si-NC组、siW-WP1#1组和siWWP1#2组细胞侵袭数目分别为(104±10)、(40±3)和(46土5)个,差异有统计学意义,F=83.910,P＜0.001;与si-NC组相比,siWWP1#1组,siWWP1#2组细胞迁移和侵袭数目均降低.CCK-8法检测敲低WWP1对肺癌细胞增殖活力影响结果显示,si-NC组,siWWP1#1组,siWWP1#2组细胞增殖活力分别为(100士8)％、(52士4)％和(42士3)％,差异有统计学意义,F=173.200,P＜0.001.与si-NC组相比,siWWP1#1组和siWWP1#2组细胞增殖活力降低.结论 WWP1在肺癌中高表达,敲低WWP1表达可促进PTEN表达,降低肺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力.WWP1可能作为肺癌的一个重要预后标志物,成为治疗肺癌的潜在分子靶点.

目的 研究芍药内酯苷(albiflorin,AL)逆转人卵巢癌多药耐药的作用和潜在机制.方法 采用CCK-8试剂盒检测AL对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转作用,采用流式细胞术检测AL对P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)功能的影响,采用RT-qPCR和Western blot检测AL对SKOV3/DDP细胞中MYC、WWP1和ABCB1/P-gp的影响.采用RNA干扰技术构建MYC敲低的SKOV3/DDP细胞株,观察其耐药性、P-gp功能及相关基因和蛋白表达变化.结果 AL对SKOV3/DDP细胞有耐药逆转作用,对P-gp功能抑制作用具有浓度依赖性.AL 25、50、100μmol·L-1对ABCB1/P-gp、MYC和WWP1的抑制作用均逐渐增强.MYC抑制剂MYCi975对ABCB1/P-gp、MYC和WWP1的抑制作用均强于或相当于AL 100μmol·L-1组.SKOV3/DDP细胞敲低MYC后,细胞耐药性、P-gp功能以及相关基因和蛋白表达均受到抑制.结论 AL对SKOV3/DDP细胞的耐药逆转作用可能与抑制P-gp功能和ABCB1/P-gp、MYC、WWP1表达有关,为AL作为耐药逆转剂用于卵巢癌的临床治疗提供了实验基础.

目的 探讨E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用及机制.方法 构建髓系细胞中特异性敲除E3蛋白泛素连接酶WWP1基因的小鼠,检测WPP1基因是否被敲除,随后进行分组,分为WWP敲除组(WWP1+/+)和WWP未敲除组(WWP1-/-),两组小鼠再分别喂养菊聚糖硫酸钠(DSS)建立炎症性肠病模型(DSS组)和喂养生理盐水(无菌水组),每组小鼠共10只,喂养7 d,每天检测小鼠结肠炎的临床症状,结束后处死小鼠,测量结肠长度,评估小鼠结肠炎损伤情况,Elisa检测小鼠结肠黏膜组织炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α水平,采用RT-qPCR和Western blot检测TLR4表达水平.同时使用基因沉默方法敲除RAW 264.7细胞的WWP1基因,使用LPS刺激构建结肠炎症情况下的巨噬细胞环境,检测WWP1+组与WWP1-组细胞中IL-6、IL-10、TNF-α和TLR4、WWP1表达水平.结果 WWP1+/+组和RAW 264.7细胞沉默组中WWP1-mRNA表达均明显下调,提示成功敲除WWP1基因.DSS组WWP1-/-小鼠体质量减轻程度明显大于DSS组WWP1+/+小鼠,DSS组WWP1-/-小鼠的DAI值明显大于DSS组WWP1+/+小鼠,DSS组WWP1+/+小鼠结肠长度明显长于DSS组WWP1-/-小鼠;与WWP1-/-相比,WWP1+/+的小鼠组织病理损伤程度更轻,结肠炎的症状更轻,同时小鼠IL-6、TNF-α表达水平明显更低,IL-10表达水平明显更高,炎症损伤程度更轻,RT-qPCR和Western blot检测结肠组织和细胞中TLR4的表达也显示,与WWP1-/-相比,WWP1+/+的小鼠TLR4表达水平明显更低,在细胞株中,WWP1+组TLR4表达水平明显更低(P＜0.05).结论 E3蛋白泛素连接酶WWP1可以对炎症性肠病中炎性聚集起到保护作用,这种保护作用的发挥可能是通过TLR4通路实现的.