应用转录组测序技术(RNA-seq)筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB相关的靶基因,为鼠伤寒沙门菌耐药机制的深入研究奠定基础.采用RNA-seq技术分析baeSR和acrB基因缺失后表达量变化的相关耐药基因,通过GO富集和KEGG通路探索其主要功能,qRT-PCR验证部分差异基因.以|log2(Fold Change)|>1且q value<0.005为条件,其中以CR△acrB和CR为比较组,共筛选到1320个差异表达基因,894个下调,426个上调;以CR△baeSR△acrB和CR为比较组,共筛选到1377个差异表达基因,972个下调,405个上调.GO富集分类结果显示差异基因主要集中在跨膜运输、细胞黏附、纤毛或鞭毛运动等功能;KEGG数据库显示,差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组份信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路.其中,ompR、csgD、fliA、fliG可通过调节细菌生物膜形成能力调控其对多种抗生素的耐药性;emrA、mdtC、yejE属于外排泵相关基因,可介导细菌对黏菌素、新生霉素等的耐药性;STM3031可赋予沙门菌头孢曲松抗性;pmrF可参与调节细菌对多粘菌素的抗性.鼠伤寒沙门菌acrB和baeSR基因缺失可影响相关耐药基因的表达.

[背景]沙门菌的多重耐药现象日渐严重,对其耐药机理的研究尤为迫切,双组分系统与细菌耐药性密切相关.[目的]构建鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失株及回补株,探究双组分系统BaeSR对鼠伤寒沙门菌耐药性的影响.[方法]以鼠伤寒沙门菌体外诱导耐药株CR为研究对象,通过自杀质粒pLP12介导的同源重组方法,以氯霉素抗性标记和阿拉伯糖诱导的致死基因vmt进行正、反向双重筛选,获得基因缺失株CR△baeSR,并将重组表达质粒pBAD-baeSR转化于CR△baeSR构建回补株CR C△baeSR.采用微量肉汤稀释法测定11种常见代表药物对野生株、缺失株及回补株的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC),并测定3株菌的生长曲线、运动性及生物膜形成能力.[结果]与野生株相比,环丙沙星(CIP)、恩诺沙星(ENR)、沙拉沙星(SAR)、头孢噻呋(CEF)、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、安普霉素(APR)对缺失株的MIC值有所下降;缺失株的生长速率稍显缓慢,且最终浓度也相对较低,但并无统计学上的显著差异(P＞0.05);缺失株的运动性(P＜0.05)及生物膜形成能力(P＜O.01)均显著下降.[结论]鼠伤寒沙门菌baeSR基因缺失后,可通过影响其运动性及生物膜形成能力而对抗生素的敏感性产生影响.

[背景]鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种重要的人兽共患病原菌,其多重耐药性问题日益严重,双组分系统可调控鼠伤寒沙门氏菌的耐药性.[目的]通过构建鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株及回补株探究BaeSR双组分系统对鼠伤寒沙门氏菌耐药性的影响.[方法]在BaeSR双组分系统和AcrB外排泵双缺失株(CR△baeSR△acrB)的基础上构建baeR过表达株(CRpbaeR△baeSR△acrB)及baeR回补株(CRcbaeR△baeSR△acrB),测定双缺失株、回补株和过表达株的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),并对其生长特性、生物膜形成能力及运动性进行分析.采用转录组学技术筛选与耐药相关的差异表达基因,RT-qPCR验证耐药相关基因.[结果]构建了鼠伤寒沙门氏菌baeR过表达株和baeR回补株.与双缺失株相比,过表达株对氧氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、乙酰甲喹、头孢他啶、头孢噻呋、阿莫西林和氨苄西林的MIC分别升高2-256倍,对大观霉素、安普霉素的MIC下降了50％;与双缺失株相比,回补株对头孢他啶、头孢噻呋、氟苯尼考、恩诺沙星的MIC分别升高了2倍;与双缺失株相比,过表达株和回补株的生长速率无明显变化,生物膜形成能力及运动能力极显著升高(P＜0.01).转录组学分析表明CRpbaeR△baeSR△acrB/CR△baeSR△acrB比较组共筛选到743个差异表达基因(上调724个,下调19个),差异表达基因主要富集在β-内酰胺抗性、群体感应系统和双组分系统等通路中;CRcbaeR△baeSR△acrB/CR△baeSR△acrB比较组共筛选到3073个差异表达基因(上调1467个,下调1606个),差异表达基因主要富集在碳代谢、氨基酸的生物合成和抗生素的生物合成等通路中.筛选出15个外排泵、鞭毛、生物膜、双组分系统及外膜蛋白等耐药相关差异表达基因,随机选取5个差异表达基因进行RT-qPCR验证,趋势与转录组一致.[结论]baeR过表达后通过调控生物膜形成及运动性从而介导鼠伤寒沙门氏菌对多种药物的耐药性.转录组学测序结果显示,15个耐药相关基因显著差异表达,表明baeR过表达后可通过调节外排泵、生物膜和鞭毛等相关基因的表达影响鼠伤寒沙门氏菌的耐药性.