目的:探究山东省潍坊市农村居民耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌（CR-ECL）耐药基因特征及核心基因组特征。方法:收集2017年山东省潍坊市农村社区居民粪便标本，使用耐碳青霉烯类肠杆菌显色培养基筛选耐药菌株，通过激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOFMS）分析获得CR-ECL阳性菌株，针对CR-ECL分离株，采用微量肉汤稀释法进行抗生素敏感性试验获得CR-ECL耐药表型，开展全基因组测序（WGS）和分析、 blaNDM基因周围环境及菌株间系统进化分析。 结果:共获得并检测628份粪便标本，6份为CR-ECL阳性（检出率0.96%），均表现为多重耐药（MDR）表型。6株CR-ECL共有4个MLST分型（ST），均携带多种耐药基因（ blaNDM-1、 blaNDM-5等）和毒力基因（ acrA、 acrB、 entB、 fepC等），且 blaNDM基因周围遗传环境中均存在移动遗传元件 ISAba125、 TN3-IS3000、 TN3及 IS5。系统发育树显示，核心基因组多位点序列分型（core genome multilocus sequence typing，cgMLST）与单核苷酸多态性（SNPs）结果具有一致性，cgMLST结果显示菌株2BC0101B与2BC0251B，2BG0561B与2BI0221B之间等位基因差异分别为2和1，SNPs结果显示上述2对菌同样各自聚成一簇，并发现美国国立生物技术信息中心数据库（National Center for Biotechnology Information，NCBI）中鸡粪样本的菌株居于进化树中心，且本地序列均可追溯到美国人源序列。 结论:山东省潍坊市农村社区居民中已检出多重耐药碳青霉烯类阴沟肠杆菌。

目的 探讨AcrAB-TolC外排泵系统在多重耐药肺炎克雷伯杆菌中的表达情况及对其耐药性的影响.方法 采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统对临床分离菌进行鉴定及药敏分析,收集多重耐药菌株;采用微量肉汤稀释法测定药物最低抑菌浓度(minimal inhibitant concentration,MIC)及其逆转实验对多重耐药肺炎克雷伯杆菌进行外排泵表型检测;利用荧光定量PCR测定外排泵acrB基因的表达情况.结果 30株多重耐药肺炎克雷伯菌在应用外排泵抑制剂羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)后,9株(30.00％)对庆大霉素的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;3株(10.00％)对阿莫西林/棒酸的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;14株(46.67％)对头孢吡肟的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;12株对左氧氟沙星(40.00％)的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下;5株(16.67％)对环丙沙星的MIC值下降至原值的1/4或1/4以下.23株(76.67％)外排泵表型阳性,荧光定量PCR结果显示28株(93.33％)高表达acrB基因.结论 外排泵AcrAB-TolC的表达增强可能是肺炎克雷伯杆菌多重耐药的重要机制之一.

目的 探讨志贺菌临床分离菌株AcrAB-TolC外排泵的3个组成基因(acrA、acrB、tolC)mRNA转录水平与其氟喹诺酮耐药水平.方法 收集2009至2015年于天津医科大学总医院、天津医科大学第二医院和天津市儿童医院3家三甲医院就诊腹泻患者的非重复粪便样本,分离培养获得192株志贺菌临床分离菌株,采用K-B纸片法对所有菌株进行体外药敏试验;根据药敏试验结果,将志贺菌株分为氟喹诺酮耐药组和氟喹诺酮全敏感组;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术,检测上述两组志贺菌临床分离株AcrAB-TolC外排泵基因在mRNA转录水平的相对表达量,使用SPSS 17.0软件对结果进行统计学分析.结果 氟喹诺酮耐药组志贺菌株共计9株(对3种及3种以上氟喹诺酮耐药的菌株),依次编码为F2、N8、F44、157、187、368、1113、3171和3327,氟喹诺酮全敏感组志贺菌株共计9株,依次编码为F13、1、22、174、186、377、1506、3283和3326;耐药组外排泵acrA基因的mRNA转录水平高于全敏感组菌株,差异具有统计学意义(t=2.97、P=0.02);耐药组外排泵acrB和tolC基因的mRNA转录水平均值虽然高于全敏感组相应基因mRNA转录水平,但差异均无统计学意义(t=2.84、P=0.30,t=1.17、P=0.29).结论 受试菌株外排泵acrA基因mRNA转录水平增高与氟喹诺酮耐药存在一定的关联.

目的 了解我国4省份禽肉中分离小肠结肠炎耶尔森菌、中间型耶尔森菌和弗氏耶尔森菌的耐药特征和耐药基因的携带情况.方法 本研究采用的22株小肠结肠炎耶尔森菌、2株中间型耶尔森菌和1株弗氏耶尔森菌来源于2016年全国污染物监测网,其中1株分离自宁夏回族自治区, 3株分离自山东省,16株分离自河北省,5株分离自黑龙江省.采用肉汤稀释法测定25株分离菌对14类25种临床常用抗生素的药物敏感性,将菌株的全基因组序列与抗生素抗性基因数据库(ARDB)比对,对基因组中的耐药基因进行预测.结果25株耶尔森菌对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸和头孢唑啉全部耐药,其中22株小肠结肠炎耶尔森菌中对头孢西丁、氨苄西林/舒巴坦、呋喃妥因和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑的耐药率分别为63.7%(14株)、22.8%(5株)、4.6%和4.6%(1株).25株菌全部耐3类及以上抗生素(多重耐药株),耐4类及以上抗生素的比例为64.0%(16株),且4株分离自鸡肉的小肠结肠炎耶尔森菌对头孢曲松、环丙沙星出现了中介耐药.25株菌株中有20株携带有相同的6种耐药基因(簇),分别为mdtG、ksgA、bacA、blaA、rosAB和acrB,有5株分离自新鲜鸡肉的小肠结肠炎耶尔森菌还携带有耐药基因dfrA1、catB2和ant3ia.结论 我国部分地区生禽肉中耶尔森菌的耐药性严重,携带有多种耐药基因.

目的 研究肺炎克雷伯菌生物膜形成能力及其与luxS、oqxB、rarA 等基因的相关性.方法 通过96孔板结晶紫染色法测定200株对亚胺培南、头孢他啶、环丙沙星和庆大霉素敏感的肺炎克雷伯菌(敏感组)和300株对上述药物耐药的肺炎克雷伯菌(耐药组)体外生物膜形成能力;采用扫描电镜观察不同生物膜形成能力肺炎克雷伯菌的生物膜形态特点;通过实时荧光定量PCR分析生物膜形成相关基因(luxS、oqxB、rarA、acrB、ramA、ompK36和micF)表达量.结果 强生物膜形成能力组的平均生物膜形成量是弱形成能力组的16.8倍,敏感组和耐药组肺炎克雷伯菌生物膜OD590的平均值分别为0.783±0.642和0.672±0.534,差异无统计学意义;扫描电镜显示生物膜形成能力强的菌株团块内包含大量的生物膜,形态完整且细菌密集排列;强生物膜形成能力组中luxS表达水平分别为中等和弱形成能力组的5.98倍和3.37倍;外排泵、外膜蛋白编码基因及其调控基因的表达水平有统计学差异.结论 肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与luxS基因的表达量有关,luxS作为一个高阶调控基因,其与ramA、ompK36和micF等基因构成错综复杂的关系网,共同影响生物膜的形成.

目的 研究大肠埃希菌AcrAB-TolC外排泵参与季铵盐化合物(quaternary ammonium compound,QAC)与氟喹诺酮类抗生素(fluoroquinolones,FQ)交叉耐药的机制.方法 78株大肠埃希菌分离自患者的临床标本,琼脂稀释法检测季胺盐化合物苯扎溴铵的敏感性,随机挑选6株菌,用苯扎溴铵进行诱导,观察菌株诱导前后对苯扎溴铵及环丙沙星敏感性的变化,荧光定量RT-PCR技术检测诱导菌株及其母株外排泵基因acrA、acrB及tolC的mRNA的转录水平.结果 78株实验菌株中,苯扎溴铵最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)范围为8～64μg/ml,47.4％的菌株MIC值高于标准菌株;诱导株acrA、tolC基因相对表达量明显高于母株,差异有统计学意义;6株诱导株环丙沙星的MIC较母株增加4～8倍.结论 推测诱导菌株acrA、tolC基因的转录水平增高与QAC和FQ交叉耐药有一定的相关性.

目的 探讨多重聚合酶链反应结合反向线性点杂交(multiplex polymerase chain reaction-based reverse line blot hybridization, mPCR/RLB)技术在检测新生儿化脓性脑膜炎病原及其耐药基因中的作用. 方法 回顾性收集2012年1月1日至2018年12月31日在首都医科大学附属北京儿童医院临床诊断为新生儿化脓性脑膜炎患儿(n=80)的病例资料及脑脊液标本(100份).入院首次采集脑脊液标本80份(使用抗生素前12份,使用抗生素后68份),另20份为治疗后复查脑脊液标本.脑脊液标本分别采用细菌培养和药敏鉴定,以及mPCR/RLB技术检测病原及其耐药情况,采用χ2检验比较2种方法的检测阳性率. 结果 (1)80例患儿入院首次脑脊液检测:mPCR/RLB 检测阳性率明显高于细菌培养 [26.3%(21/80)与 7.5%(6/80),χ2 =10.025, P=0.002].使用抗生素前的脑脊液标本mPCR/RLB检测阳性率与细菌培养差异无统计学意义(9/12与5/12,χ2 =1.543,P=0.214);使用抗生素后的脑脊液标本mPCR/RLB检测阳性率高于细菌培养[17.6%(12/68)与1.5%(1/68),χ2=13.176,P＜0.001].(2)复查脑脊液标本:细菌培养均阴性, mPCR/RLB阳性4例.该4例患儿首次脑脊液细菌培养阳性,mPCR/RLB结果亦阳性,且mPCR/RLB病原结果与细菌培养结果相符.(3)病原:细菌培养检出大肠埃希菌3例,B族链球菌2例,李斯特菌1例;mPCR/RLB技术在首次脑脊液标本中检出大肠埃希菌4例,B族链球菌5例,李斯特菌4例,脑膜炎奈瑟球菌4例,流感嗜血杆菌b型、革兰阴性菌和革兰阳性菌各1例,李斯特菌和流感嗜血杆菌b型混合感染1例.(4)耐药基因:1例大肠埃希菌药敏结果为超广谱β-内酰胺酶阳性.mPCR/RLB检出acrA阳性3例,acrB阳性2例,TetM阳性1例,CTX-M阳性1例(与药敏结果相符). 结论 mPCR/RLB与细菌培养相比阳性率高,一致性好,且可同时检测耐药基因,具有临床应用价值.

应用转录组测序技术(RNA-seq)筛选鼠伤寒沙门菌baeSR和acrB相关的靶基因,为鼠伤寒沙门菌耐药机制的深入研究奠定基础.采用RNA-seq技术分析baeSR和acrB基因缺失后表达量变化的相关耐药基因,通过GO富集和KEGG通路探索其主要功能,qRT-PCR验证部分差异基因.以|log2(Fold Change)|>1且q value<0.005为条件,其中以CR△acrB和CR为比较组,共筛选到1320个差异表达基因,894个下调,426个上调;以CR△baeSR△acrB和CR为比较组,共筛选到1377个差异表达基因,972个下调,405个上调.GO富集分类结果显示差异基因主要集中在跨膜运输、细胞黏附、纤毛或鞭毛运动等功能;KEGG数据库显示,差异基因主要富集在代谢途径、ABC转运系统、双组份信号转导系统、鞭毛组装、β-内酰胺抗性等通路.其中,ompR、csgD、fliA、fliG可通过调节细菌生物膜形成能力调控其对多种抗生素的耐药性;emrA、mdtC、yejE属于外排泵相关基因,可介导细菌对黏菌素、新生霉素等的耐药性;STM3031可赋予沙门菌头孢曲松抗性;pmrF可参与调节细菌对多粘菌素的抗性.鼠伤寒沙门菌acrB和baeSR基因缺失可影响相关耐药基因的表达.

目的 研究耐碳青霉烯类大肠埃希菌(CREC)对替加环素异质性耐药的分子机制,为临床治疗和合理应用抗生素提供依据.方法 收集2017年1月至2019年3月间多中心分离的CREC,用改良E-test法和菌群谱型分析微量滴定法(MPAP)初筛,群体谱分析法(PAP)确认CREC对替加环素的异质性耐药情况,并用荧光定量RT-qPCR分析外排泵相关基因、外排泵调节基因和膜孔蛋白基因的表达.结果 改良E-test法和MPAP法筛查CREC对替加环素异质性耐药(CREC-TGC-HR)的阳性率分别为25.0％(14/56)和39.3％(22/56).经PAP法确认,有37.5％(21/56)为阳性.改良E-test法的CREC-TGC-HR检出率低于PAP法,差异有统计学意义(P<0.05).3家医院CREC-TGC-HR的检出率分别是43.8％(7/16)、43.5％(10/23)和23.5％(4/17),两两比较差异均无统计学意义(P>0.05).与CREC-TGC-HR原始菌株相比,耐药亚群外排泵基因acrA、acrB表达分别上调1.79倍、5.01倍;其相关调控基因marA、marB表达分别上调5.38和2.18倍;膜孔蛋白基因ompC表达下调2.35倍,差异均有统计学意义(P<0.05).膜孔蛋白基因ompF和ompX的表达比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 首次报道CREC对替加环素异质性耐药,且异质性耐药率较高,需要采用有效的方法检测CREC-TGC-HR,为临床治疗和合理应用抗生素提供依据.

为探讨青蒿琥酯(artesunate,ASN)单独或联合头孢菌素类药物对多重耐药(multidrug-resistant,MDR)肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的抗菌活性.本研究收集2018年长沙市中心医院临床分离的多重耐药肺炎克雷伯菌菌株32株.分为单独用药组:青蒿琥酯(ASN)组、头孢曲松钠(CRO)/头孢他啶(CAZ)组和联合应用组.采用细菌动态生长曲线法观察青蒿琥酯联合头孢菌素类药物对多重耐药肺炎克雷伯菌的生长影响;采用微量肉汤稀释法检测青蒿琥酯单独或联合头孢菌素类药物对多重耐药肺炎克雷伯菌的抗菌作用;采用RT-PCR技术检测外排泵基因AcrB mRNA以及其调控基因MarA和AcrR mRNA的表达水平.结果 显示,终浓度为2048μg/mL ASN联合头孢曲松钠、头孢他啶明显地抑制了多重耐药肺炎克雷伯菌的生长,曲线走向平缓;终浓度为1024μg/mL ASN联合头孢曲松钠、头孢他啶对多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC50与单独用药组比较显著减低,均有统计学意义(K=68.07,P＜0.05;K=62.34,P＜O.05).1024 μg/mL ASN联合头孢曲松钠、头孢他啶均以相加作用为主;2048μg/mL青蒿琥酯和头孢曲松钠、头孢他啶联用时,可以抑制外排泵基因AcrB的表达,2048 μg/mL青蒿琥酯联合512 μg/mL头孢曲松钠明显抑制正向调控子MarA的表达,而对于负性调控子AcrR的表达没有明显影响.青蒿琥酯能显著改善多重耐药肺炎克雷伯菌对头孢曲松钠以及头孢他啶的敏感性,其机制可能与下调外排泵基因AcrB的表达有关.