基于CRISPR-dCas9的基因转录激活表达能够避免基因异位表达带来的表型干扰,同时使基因有效地特异性表达.该研究利用新型CRISPR-Act3.0表达系统,在毛果杨(Populus trichocarpa)中对维管形成层特异表达转录因子ANT(AINTEGUMENTA)进行基因转录激活,创制遗传材料,并对基因的功能进行分析.首先对毛果杨PtrANTs转录因子进行同源分析,选取其中的PtrANT-4进行后续研究,对该基因进行克隆并利用荧光定量PCR分析其在各组织中的表达情况;其次在PtrANT-4启动子上设计3条gRNAs,构建CRISPR-dCas9转录激活表达载体,利用原生质体瞬时转化法检测该载体的表达;最后将该表达载体利用农杆菌介导法转化毛果杨,获得PtrANT-4转录激活遗传材料.结果表明:毛果杨中有4个PtrANTs转录因子,选取的PtrANT-4基因CDS序列全长为2 058 bp,编码685个氨基酸,在毛果杨侧生分生组织维管形成层特异表达.基于CRISPR-Act3.0表达系统成功构建的转录激活载体,在毛果杨木质部原生质体中转化后具有激活PtrANT-4表达的作用.获得的遗传转化植株中PtrANT-4基因仅在茎维管形成层中的表达量显著提高,说明PtrANT-4在茎维管形成层发育过程中可能起重要作用.该研究为PtrANT的功能研究奠定了一定研究基础,同时为维管形成层干细胞发育的机制研究提供了重要的遗传材料.

本研究旨在探索VASA基因在绵羊睾丸发育中的表达变化,并通过构建VASA基因敲入载体,为下一步进行绵羊生殖细胞体外诱导分化研究提供基础.采集性成熟前后即 3 月龄(3-month-old,3M)和 9 月龄(9-month-old,9M)绵羊睾丸组织,利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和Western blotting技术分析VASA基因的差异表达,并利用免疫组织化学技术对VASA基因的表达定位进行分析.设计靶向VASA基因的向导RNA(guide RNA,gRNA),并构建同源重组载体,进行质粒转染绵羊耳成纤维细胞.结合CRISPR/dCas9技术对VASA基因进行激活,进一步验证载体效率.结果表明,VASA 基因随着绵羊睾丸发育,表达水平极显著增加(P<0.01),且主要定位在精母细胞和圆形精子细胞中.利用CRISPR/Cas9系统构建了VASA基因敲入载体,联合pEGFP-PGK puro-VASA载体转染耳成纤维细胞,CRISPR/dCas9 系统激活后,耳成纤维细胞成功表达 VASA 基因.结果提示,VASA 基因在绵羊睾丸发育和精子发生中发挥潜在功能,且通过CRISPR/Cas9系统可在体外构建VASA基因敲入载体,为下一步探究VASA基因对绵羊雄性生殖细胞的发育和分化提供有效的研究手段.

临床研究表明着丝粒蛋白 F(centromere protein F,CENPF)与肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生相关.由于CENPF蛋白的分子量高达 358 kDa,目前有关CENPF致癌机制研究使用的体内外模型主要基于CENPF表达敲低,尚缺乏将CENPF过表达以探究其与癌变因果关系的研究,CENPF 过表达改变到底是"因"还是"果"仍不清楚.本研究旨在利用包括 lentiMPHv2 和lentiSAMv2 两个载体的CRISPR/dCas9 转录激活协同激活介体(synergistic activation mediator,SAM)系统构建内源性CENPF稳定过表达的细胞模型,为阐明CENPF过表达与HCC发生发展的因果关系提供有效工具.首先设计并合成能够特异性识别 CENPF 基因转录起始位点的单向导核糖核酸(single guide RNAs,sgRNA),并将其插入lentiSAMv2 质粒中.利用慢病毒载体将lentiMPHv2 质粒导入Huh-7和HCCLM3细胞株中,用潮霉素B筛选后再用慢病毒载体将连接好的携带sgRNA序列的lentiSAMv2 质粒导入细胞中,并用杀稻瘟菌素S继续筛选.对 2 种抗生素筛选获得的Huh-7 和HCCLM3 细胞株样品进行CENPF mRNA和蛋白表达水平的检测,结果显示sgRNA1 和sgRNA4 序列均能够激活内源 CENPF 的表达,其中 sgRNA4 诱导转录效果更加明显.本研究利用CRISPR/dCas9系统成功构建内源性CENPF稳定过表达的HCC细胞模型,为研究CENPF过表达与肿瘤发生的因果关系奠定基础,并为构建大分子量蛋白过表达的细胞模型提供参考方案.

随着人类等物种的基因组计划的完成,关于基因组的研究已经从结构基因组学转向了功能基因组学.将基因组的序列信息转化为功能信息,解密生命的密码,完成基因组的功能注释对于全面理解生长发育、疾病衰老、学习记忆等过程具有重大意义.黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)具有易于饲养、生命周期短、繁殖能力强、染色体简单等诸多优点,因此成为科研领域最为经典、最为重要的模式生物之一.更为重要的是,果蝇基因高度保守且与人类基因同源性高,80%以上果蝇基因与人类基因同源, 60%以上人类致病基因都存在果蝇中.利用果蝇的遗传技术,可以方便地研究基因功能.据文献报道,许多重要基因编码的蛋白质(如 polycomb、HP1等)和重要的细胞信号通路(如 Hh、Toll 等)就是首先在果蝇中发现,随后在其他模式动物和人类中被发现而且发挥同样功能.因此,果蝇上的研究成果可供对人类疾病的相关研究借鉴参考,同时还摆脱了伦理方面的限制.

CRISPR/Cas9系统已不仅仅是一种革命性的基因编辑工具,还能在各种原核和真核生物中调控基因转录.近年来,由CRISPR/Cas9衍生而来的CRISPR-dCas9系统已被用于基因成像、高通量筛选、基因调控、必需基因功能研究及表观遗传调控等多个方向.总结了近年来CRISPR-dCas9系统在激活或抑制基因转录、降低脱靶效率、sgRNA与转录强度及特异性之间的联系等方面的研究进展,以期对CRISPR-dCas9系统定向调控基因转录的研究提供参考和帮助,并就其未来可能的改进进行了展望.

目的 改进和提高HIV体外扩增检测的灵敏度,缩短检测时间.方法 1)用Broad Institute gRNA设计工具选取HIV的长末端重复序列(LTR)段设计20条gRNA(引导RNA).2)用含荧光素酶报告的基因HIV(HIV-Luc)感染具有dCas9基因激活系统的Jurkat6465细胞系构建Jurkat6465-Luc细胞系,并将20条gRNA置于Jurkat6465-Luc细胞系中筛选出激活能力筛选,选取效率最高的gRNA-L,gRNA-L与dCas9基因激活系统包装成慢病毒感染Jurkat细胞系,建立可对HIV序列高效扩增的工作细胞系Jurkat6465-L.3)用HIV-Luc感染Jurkat细胞系构建HIV潜伏测试细胞系,设定其潜伏频率为1∶500,并与工作细胞Jurkat6465-L置于细胞培养箱中共同培养7和14d观察工作细胞对HIV潜伏细胞系的激活能力.4)使用HIV激活剂SAHA和dCas9基因激活系统分别作用于设定潜伏频率为1∶500的潜伏细胞,分别比较对潜伏HIV的激活能力.结果 首先,测定荧光素酶活性筛选出的2条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O,二者及对照组促进Jurkat6465-Luc的扩增效力(荧光素酶活性强度)(n=3,pg/mL),6d分别为:85 530±979.2 vs 96 925±2 759 vs 9 876±437(P＜0.01);选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞,测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏测试细胞,在培养7、14d激活HIV潜伏测试细胞的频率测定分别1/864和1/755,比培养14 d用SAHA激活HIV潜伏模型细胞频率1/1 180更接近设定潜伏频率值1/500;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照SAHA激活剂激活HIV潜伏细胞频率1/749相比,更接近于设定频数1/500.结论 dCas9基因激活系统改进HIV体外扩增,可以提高HIV体外扩增检测的效率和灵敏度.

CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑系统,随着研究的深入,科学家建立了调控基因组转录的CRISPR-dCas9系统.该系统的建立基于dCas9的发现,dCas9丧失核酸酶活性,虽不具有DNA切割活性,但仍然具有DNA结合活性,其可在sgRNA的引导下靶向目的基因,将特定的转录激活因子(或抑制因子)携带至目的基因上游,实现对目的基因的转录激活(CRISPRa)或转录抑制(CRISPRi).目前该系统已用于遗传病治疗的实验研究,取得了可喜的进展,具有潜在的临床应用价值.该文从CRISPR-dCas9系统建立、发展以及在几种遗传病治疗领域的研究进行了综述.

运用由CRISPR/Cas9技术延伸的两种转录激活系统Cas9-p300和dCas9-VPR分别激活生殖特化相关基因,比较它们针对生殖细胞特化基因的激活效率.实时荧光定量PCR结果表明,这两种激活系统均可激活大部分目的基因的表达.其中,Cas9-p300系统激活BLIMP1基因的效率更高,dCas9-VPR系统激活NANOS2、DAZL、SOX17基因的效率更高,两种系统在激活DDX4、TFA P2C基因时效率无显著性差异.由此,本研究通过比较Cas9-p300和dCas9-VPR转录激活系统调控生殖特化相关基因的表达,揭示了不同的转录激活系统在激活生殖特化相关基因时的不同效率,这将为利用转录激活系统研究生殖细胞分化提供理论基础,也将为研究其他发育系统中细胞命运的转变提供借鉴.

近日,美国加州大学圣地亚哥分校赵云德教授团队在 aBIOTECH 期刊在线发表文章"Positional effects on efficiency of CRISPR/Cas9-based transcriptional activation in rice plants".该团队利用 CRISPR / dCas9 系统研究了引导 RNA(gRNA)在启动子的位置对基因转录激活效应的影响,对于分子设计育种中进行精确有效的基因激活具有重要的指导意义.

由Cas9核酸酶和单向导RNA(sgRNA)组成的CRISPR/Cas9系统,可对sgRNA靶向的DNA序列进行缺失、插入和点突变等基因重编程操作,是新兴的基因编辑技术.此外,CRISPR/dCas9(Cas9核酸酶活性丧失的突变体),仍保留sgRNA靶向结合DNA的能力,dCas9蛋白融合转录激活物(CRISPRa)后可激活目标基因表达,也可通过融合转录阻遏物(CRISPRi)抑制目标基因表达.CRISPR/Cas9系统的高效输送是限制其临床广泛应用的主要问题之一.病毒载体被广泛用于递送CRISPR/Cas9元件;但就安全性、简便性和灵活性而言,非病毒载体研究更具吸引力.本文主要总结了CRISPR技术的原理和研究进展,包括CRISPR/Cas9的递送载体,递送模式以及递送过程的障碍,并回顾基于CRISPR技术在骨和软骨组织工程中的研究进展,讨论CRISPR技术在骨和软骨组织工程应用中面临的挑战和未来.