目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

目的 原核表达并纯化麻疹病毒(measles virus,MV)核蛋白(N),免疫家兔后制备兔抗MV N抗血清,并鉴定其特异性.方法 以MV-S191疫苗株基因组为模板,PCR扩增N基因3个片段,构建重组表达质粒pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2和pGEX-MV-N3,分别转化至E.coli BL21(DE3)中诱导表达N-末端带有GST标签的融合蛋白GST-MV-N1、GST-MV-N2和GST-MV-N3,纯化后,分别与等体积弗氏完全佐剂(初次免疫)、弗氏不完全佐剂(加强免疫)混合,乳化均匀后各免疫1只雌性家兔,共免疫6次,采集全血,分离血清获得兔抗MV N抗血清,Western blot法及间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)鉴定其特异性.结果 重组表达质粒 pGEX-MV-N1、pGEX-MV-N2 和pGEX-MV-N3经双酶切、PCR及测序鉴定证明构建正确;表达的GST-MV-N1和GST-MV-N3融合蛋白相对分子质量分别约42 000和39 000,主要以包涵体形式存在,纯度分别为96％和85％,而上清和沉淀中均未见GST-MV-N2融合蛋白的表达;兔抗MVN3抗血清能特异性识别MV-S191感染细胞后表达的N蛋白,且特异性高于兔抗MV-N1抗血清.结论 成功制备了兔抗MV N抗血清,为重组MV疫苗的研发以及MV结构蛋白抗体的制备提供了技术支持.

目的 利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶(CV2025)基因序列构建重组质粒pET-28a-CV2025,并在大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)中进行原核表达.方法 将CV2025基因序列与pET-28a(+)载体连接,构建重组质粒pET-28a-CV2025,转化E.coliTOP10中进行阳性克隆子筛选,经双酶切及测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,诱导表达目的蛋白;将重组菌28a-CV2025-BL21活化后接种2TY液体培养基,IPTG诱导表达制备粗酶液后,以异丙胺为氨基供体,1-(4-甲氧苯基)乙酮、邻氟苯乙酮、苯乙酮为氨基受体,采用薄层色谱法监测反应,初步检验转氨酶活性,高效液相色谱法进行进一步分析.结果 重组质粒pET-28a-CV2025经双酶切及测序鉴定证明构建正确;重组菌28a-CV2025-BL21、28a-CV2025-Rosetta的表达产物均可见相对分子质量约51 000的目的蛋白条带,且28a-CV2025-BL21表达的蛋白大部分以可溶性形式存在;酶液催化后,1-(4-甲氧苯基)乙酮与异丙胺发生转氨基化反应,生成对应的手性胺1-(4-甲氧苯基)乙胺,具有一定的催化活性.结论 在E.coli中成功表达了CV2025,初步检验上清中可溶性蛋白具有酶活性,为后期转氨酶的分离、纯化以及增强产物转化率奠定了基础.

目的 构建表达新型冠状病毒(SARS-CoV-2)Omicron BA.1变异株S1蛋白的真核表达载体,在CHO-K1细胞中进行表达,评价其免疫原性,并对佐剂和抗原剂量进行研究.方法 构建重组质粒UCOE-Omi-S1,转染至CHO-K1工程细胞中进行表达和纯化,通过SDS-PAGE和Western blot法实验鉴定重组S1蛋白.将BALB/c小鼠随机分为12组,即 PBS组,无佐剂组(高、中、低剂量组),铝盐佐剂对照组,MF59佐剂对照组,铝盐佐剂实验组(高、中、低剂量组),MF59佐剂实验组(高、中、低剂量组),将按照分组要求配比的溶液经小鼠肌内注射3次,间隔14天,每2周尾静脉采血,末次免疫30天后取血分离血清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清抗体水平,并和SARS-CoV-2原型株的假病毒和SARS-CoV-2 Omicron BA.1变异株的假病毒进行假病毒中和实验.结果 目的蛋白在CHO-K1工程细胞表达后可分泌到培养上清中,在相对分子质量约为70kDa处可见1条特异性蛋白表达条带,经Western blot法鉴定为Omi-S1蛋白.铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果优于无佐剂组,铝盐佐剂组和MF59佐剂组免疫诱导效果相差不大,但MF59佐剂起效快;高、中、低剂量组的免疫诱导效果在第8周相差不大,但高剂量组起效快.假病毒中和实验表明,MF59佐剂实验组针对Omicron变异株的中和抗体水平高于铝盐佐剂组.结论 本研究所构建的Omicron S1重组蛋白免疫原性良好,在小鼠体内产生了良好的体液免疫应答,并诱导高水平的对抗SARS-CoV-2假病毒的中和抗体,对佐剂和抗原剂量初步研究,结果显示,10μg以下抗原剂量搭配MF59佐剂可获得较好的免疫效果.本研究为SARS-CoV-2变异株的重组蛋白疫苗的研制提供了实验基础.

目的:构建早老蛋白增强子2（PSENEN）基因沉默的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型，探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法:设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列，与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒，经酶切及测序鉴定后，进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染：shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液，NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液，空白组不加病毒液。转染完成后，荧光显微镜下观察荧光表达，流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性，实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白（NCT）、早老蛋白1（PS1）、前咽缺陷蛋白1a（APH1a）mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析，组间两两比较采用LSD- t检验。 结果:倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达，流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示，与NC组（1.054 ± 0.272、1.076 ± 0.075）相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA（0.187 ± 0.010、0.163 ± 0.022、0.174 ± 0.009）、蛋白（0.219 ± 0.097、0.208 ± 0.014、0.185 ± 0.062）表达均显著降低（均 P < 0.001）。CCK8法显示，与NC组相比，shRNA1组细胞增殖活性在0、12、36、48 h均显著增高（均 P < 0.05），24和60 h差异无统计学意义（均 P > 0.05）；shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组（均 P < 0.05）。shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组、NC组、空白组间NCT、PS1、APH1a基因mRNA表达差异无统计学意义（ F值分别为8.168、4.644、1.981，均 P > 0.05），mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义（ F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663，均 P ≤ 0.01）。与NC组相比，shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低（均 P < 0.01），imNCT蛋白表达变化无统计学意义（均 P > 0.05）。 结论:成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型，PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强，γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

目的:观察重症肌无力（MG）患者白细胞介素（IL）-36的表达，研究IL-36对MG患者调节性T细胞（Tregs）和Th17细胞的调控作用。方法:入组2016年7月至2021年8月新乡市中心医院就诊的MG患者51例（MG组）和健康对照者25名（对照组），采集外周血，分离血浆和外周血单个核细胞（PBMCs），采用酶联免疫吸附试验检测血浆IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36RA、IL-35、IL-17水平，流式细胞术检测Tregs和Th17细胞比例，实时定量聚合酶链反应法检测叉头盒蛋白3（FoxP3）和维甲酸相关孤独核受体γt（RORγt）mRNA表达。用重组IL-36β（5 ng/ml）刺激MG患者的PBMCs或纯化的Tregs，分析Tregs和Th17细胞比例、IL-35和IL-17分泌、FoxP3和RORγt mRNA表达、Tregs抑制活性的变化。结果:IL-36α、IL-36γ、IL-36RA水平在对照组和MG组之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05）。MG组IL-36β水平高于对照组［（73.43±13.91）pg/ml比（60.91±12.65）pg/ml， t=3.79， P<0.001）。MG组Tregs比例［（4.67±1.33）%比（6.32±1.81）%， t=4.48， P<0.001］、IL-35水平［（50.06±7.93）pg/ml比（65.37±8.90）pg/ml， t=7.59， P<0.001］、FoxP3 mRNA（1.03±0.14比1.57±0.46， t=7.78， P<0.001）低于对照组，而Th17细胞比例［（1.05±0.15）%比（0.94±0.21）%， t=2.61， P=0.011］、IL-17水平［（40.61±13.13）pg/ml比（33.09±11.48）pg/ml， t=2.44， P=0.017］、RORγt mRNA（1.26±0.16比1.03±0.13， t=6.08， P<0.001）高于对照组（均 P<0.05）。上述指标在不同性别之间、早发型和晚发型之间、非胸腺瘤组和胸腺瘤组之间、不同Osserman分型之间的差异均无统计学意义（均 P>0.05），与定量重症肌无力（QMG）量表评分均无明显相关性（均 P>0.05）。重组IL-36β对MG患者PBMCs增殖无影响（ P=0.248），可降低Tregs比例［（3.05±0.66）%比（4.18±1.07）%， t=4.23， P<0.001］、IL-35分泌［（48.12±10.93）pg/ml比（56.96±13.73）pg/ml， t=2.36， P=0.023］和FoxP3 mRNA表达（0.99±0.17比1.18±0.13， t=4.01， P<0.001），但对Th17细胞比例、IL-17分泌和RORγt mRNA表达无影响（均 P>0.05）。重组IL-36β刺激的Tregs免疫抑制活性减弱，表现为细胞增殖升高［（0.83±0.12）×10 5个比（0.69±0.15）×10 5个， t=3.02， P=0.005］和IL-35分泌降低［（28.71±10.08）pg/ml比（37.12±10.47）pg/ml， t=2.39， P=0.023］。 结论:MG患者中升高表达的IL-36β可能主要通过抑制Tregs功能调控Tregs/Th17细胞平衡。

目的:制备靶向甲型流感病毒血凝素(hemagglutinin，HA)蛋白的广谱抗体FHA3，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，PCR扩增FHA3重链和轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FHA3。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FHA3。ELISA检测FHA3与甲型流感病毒HA的结合。假病毒感染宿主细胞试验检测抗体FHA3的体外中和活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FHA3。FHA3与甲型流感病毒H1N1 HA、H2N2 HA、H3N2 HA、H5N1 HA、H7N9 HA以及H9N2 HA均识别结合，且呈浓度依赖效应。FHA3具有较好的体外中和活性，在低浓度下(5 μg/ml)能有效阻断H5N1以及H7N9假病毒入侵靶细胞，在0.012 5 μg/ml浓度下能有效阻断H1N1假病毒入侵靶细胞。结论:获得1株具有体外中和活性的靶向甲型流感病毒HA蛋白的广谱抗体。

目的:构建细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达EgG1Y162-2重组蛋白，为研制细粒棘球蚴疫苗提供研究基础。方法:以细粒棘球蚴cDNA为模板，利用PCR法合成EgG1Y162-2目的基因，经限制性内切酶 EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切后连接到原核表达载体pET30a中，构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒；将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，经异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达大量蛋白，采用亲和层析方法纯化重组蛋白；经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白纯化水平，蛋白免疫印迹（Western blot）法鉴定表达产物。 结果:成功构建pET30a-EgG1Y162-2重组质粒，诱导表达后菌体上清液和洗脱液均在相对分子质量约15 × 10 3处出现EgG1Y162-2蛋白目的条带，且200 mmol/L咪唑洗脱的蛋白抗原成分较纯。Western blot结果显示，纯化后带有His标签的EgG1Y162-2重组蛋白能被抗His单克隆抗体识别。 结论:成功构建了细粒棘球蚴pET30a-EgG1Y162-2原核表达重组质粒，诱导表达了EgG1Y162-2重组蛋白，为进一步开展抗细粒棘球蚴疫苗的研究奠定基础。

目的:构建共表达P1和3CD的重组杆状病毒，利用昆虫细胞重组表达2型脊髓灰质炎病毒(poliovirus type 2，PV2)的病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)，制备PV2-VLP进行初步免疫原性研究。方法:基于粉纹夜蛾细胞(High 5)密码子偏好性，将PV2的P1基因和3CD基因进行序列优化，并对P1基因进行稳定性突变，构建突变型rBac-PV2-P1s-3CD和野生型rBac-PV2-P1-3CD杆状病毒。Western blot分别检测目的蛋白表达量，离子交换层析纯化PV2-VLP，透射电镜观察VLP高级结构确定组装效率。免疫大鼠评估免疫原性。结果:成功构建了可稳定表达P1s蛋白和3CD蛋白的重组杆状病毒。Western blot结果表明热稳定性突变后VLP产量相比野生型有所提高。电镜观察发现直径约30 nm的三维结构，表明VLP成功组装。动物实验结果表明，重组制备的PV2-VLP具有免疫原性，且能有效刺激产生中和抗体。结论:用昆虫细胞-杆状病毒表达系统可成功制备有效的VLP类疫苗，为PV-VLP疫苗的研制提供参考。

目的:制备1株靶向甲型流感病毒N1亚型神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的功能性抗体FNA1，并对其进行鉴定。方法:依据单链抗体(single-chain antibody fragment，scFv)序列信息，合成FNA1重链以及轻链可变区序列，连入抗体哺乳细胞表达载体pFRT-IgG1κ，构建重组表达质粒pFRT-IgG1κ-FNA1。利用瞬时高效表达系统ExpiCHO以及亲和纯化技术获取抗体蛋白FNA1。ELISA检测FNA1与甲型流感病毒N1亚型NA抗原的结合，流式细胞术分析FNA1与细胞膜表面表达N1亚型NA抗原的结合。通过抗体抑制NA蛋白活性试验检测抗体FNA1的体外功能活性。结果:蛋白质电泳结果显示制备获取了高纯度FNA1。FNA1特异性识别结合N1亚型的NA抗原，且呈浓度依赖效应。FNA1能通过结合细胞膜表面表达的N1亚型NA蛋白，有效阻断细胞膜表面的NA活性，从而抑制包装的假病毒从细胞表面释放，继而抑制进一步的靶细胞感染。结论:获得1株具有体外功能活性的靶向甲型流感病毒N1亚型NA蛋白的抗体FNA1。