目的 探讨亚抑菌浓度庆大霉素(GEN)对铜绿假单胞菌(PAO1)浮游菌和生物膜的影响.方法 采用微量肉汤稀释法检测PAO1对GEN的敏感性.采用96孔板比浊法检测亚抑菌浓度GEN对PAO1浮游菌生长的影响,并通过结晶紫染色法检测亚抑菌浓度GEN对PAO1生物膜形成的影响.采用化学反应比色法测定亚抑菌浓度GEN对PAO1毒力因子表达的影响.结果 GEN对PAO1的最低抑菌浓度为2μg/ml;而当GEN浓度≤0.250μg/ml时,不影响PAO1浮游菌的增殖;当GEN为0.125μg/ml时,能促进PAO1生物膜的形成(P＜0.05),且在一定范围内(0.125～0.250μg/ml)随着GEN浓度增高,其促进生物膜形成的能力越强;0.125和0.250 μg/ml GEN能促进群体密度信号系统相关基因lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsC、pqsD和毒力因子青脓素、弹性蛋白酶、碱性蛋白酶的表达(P＜0.05),且呈一定的剂量依赖性.结论 亚抑菌浓度GEN在一定浓度范围内能促进PAO1生物膜的形成,并进一步促进群体密度信号系统相关基因和毒力因子的表达.

目的 探讨3-oxo-C12-HSL对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞自噬的影响.方法 用LasI基因(3-oxo-C12-HSL合成基因)缺失型和野生型的铜绿假单胞菌(PA)菌株的培养物上清液以及化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子处理MH-S细胞,激光共聚焦荧光显微镜观察LC3-GFP荧光斑点以及Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值来监测自噬的形成,同时检测p62的降解以及氯喹对LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的影响来监测自噬流(autophagic flux)的变化.结果 野生型PA菌株的培养物上清液使MH-S细胞LC3-GFP荧光斑点增多(P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加(P<0.01),LasⅠ基因缺失型PA菌株不能引起上述自噬相关指标的改变.化学合成的3-oxo-C12-HSL信号分子能够明显增加自噬体数量,上调LC3Ⅱ的表达(P<0.01);自噬底物p62随着3-oxo-C12-HSL作用时间的延长而进行性降解,溶酶体抑制剂氯喹可增强3-oxo-C12-HSL引起的LC3Ⅱ累积(P<0.05,P<0.01).结论3-oxo-C12-HSL可增加MH-S细胞的自噬水平.

目的:探讨泛耐药铜绿假单胞菌(PA)群体行为与群体感应系统(QS)基因的相关性.方法:检测PA群体行为包括弹性蛋白酶、绿脓菌素和生物被膜(BF)等和QS基因表达量,分别在泛耐药PA组和全敏感PA组观察PA群体行为与QS基因表达量的相关性.结果:收集泛耐药PA和全敏感PA各5例病例,各10株PA.泛耐药PA组弹性蛋白酶和绿脓菌素与LasI呈正相关关系(P<0.05),BF与RhlR呈正相关关系(P<0.05);全敏感PA组群体行为与QS基因无相关关系(P>0.05).泛耐药PA组与全敏感PA组第1天收集RhlI和第14天收集LasI、LasR表达量差异有统计学意义(P<0.05),弹性蛋白酶、BF和LasI、LasR治疗前后表达量变化差异有统计学意义(P<0.05).1株泛耐药PA发生氨基酸突变.结论:泛耐药PA群体行为与QS基因相关,且弹性蛋白酶、BF和LasI,LasR表达过高,提示QS基因在PA耐药机制中起重要作用.

目的 探讨lasI/rhlI基因缺失和阿奇霉素对铜绿假单胞菌(PA)毒力基因表达的影响.方法 将野生型及lasI/rhlI基因缺失的PA菌株(PA-ΔlasI,PA-ΔrhlI,PA-ΔlasIrhlI)培养6 h,同时以2μg/mL的阿奇霉素处理上述菌株6 h,采用荧光定量PCR技术观察lasI/rhlI基因缺失以及阿奇霉素对铜绿假单胞菌QS系统及其毒力基因表达的影响.结果 缺失lasI基因后,其下游毒力基因lasA、aprX、rhlA、rhlB、phnA及phnB的表达水平均下调(P<0.05,P<0.01),而上述毒力基因在rhlI基因缺失后表达水平则无明显变化.阿奇霉素处理PA后,lasI基因的表达水平明显下降(P<0.01),而lasI下游毒力基因的表达水平明显增高(P<0.01,P<0.001),QS系统抑制剂qscR的表达水平也显著上调(P<0.001).结论 lasI基因缺失可以明显抑制铜绿假单胞菌QS系统毒力基因的表达,阿奇霉素可能通过抑制qscR而促进毒力基因的表达.

目的:研究中药四季青水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜生成、毒力因子分泌的抑制作用并探讨其作用机制.方法:将四季青水煎液与铜绿假单胞菌共同培养,观察四季青水煎液在亚抑菌浓度下对细菌生长的影响;将铜绿假单胞菌培养3天构建生物被膜模型,加入不同浓度的四季青水煎液共同培养,于不同时间取样,经结晶紫染色后570 nm处测定生物被膜的光密度(OD值);将不同浓度四季青水煎液与铜绿假单胞菌共同培养18 h,经氯仿提取后于540 nm处测定绿脓菌素光密度(OD值),与刚果红反应后,492nm处测定弹性蛋白酶光密度(OD值);用荧光定量PCR法检测四季青水煎液作用于铜绿假单胞菌后LasI/R和RhlI/R基因的表达;用LC-MS/MS法测定不同浓度四季青水煎液与铜绿假单胞菌共同培养48h,72 h后培养液中细菌信号分子3-oxo-C12-HSL和C4-HSL的浓度及与生物被膜生长及毒力因子分泌的关系.结果:在亚抑菌浓度下四季青水煎液不影响铜绿假单胞菌的生长,但能显著抑制铜绿假单胞菌生物被膜生成和毒力因子分泌.其减毒作用机制可能是四季青中含有铜绿假单胞菌群体感应系统抑制成分,抑制了该系统中上游信号分子3-oxo-C12-HSL与LsaR基因的结合,从而阻断了下游基因的启动.结论:四季青水煎液能通过影响铜绿假单胞菌群体感应系统中信号分子对相关基因进行调控,从而降低铜绿假单胞菌的致病性.

[背景]禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类主要病原菌之一,群体感应(Quorum sensing,QS)系统可通过信号分子调控其生物学特性.在 APEC中信号分子 AHL对其生物学特性的影响目前尚不清楚.[目的]研究信号分子 AHL对 APEC生物学特性的影响.[方法]将含铜绿假单胞菌酰基高丝氨酸内脂合成酶(Acyl-homoserine-lactone synthase,lasI)基因的表达质粒转化至 APEC菌株DE17中,构建重组菌株 DE17-lasI,利用 LasI在 DE17中合成AHL.比较野生株和重组菌林产生 AHL信号分子、生长特性、生物被膜形成能力、运动性以及耐药性等生物学特性的差异;运用 Real-time PCR技术,比较野生株和重组菌林中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平.[结果]对重组菌株 AHL信号分子检测表明,DEI7-lasI能够产生 AHL信号分子,与野生株 DE17相比,DEI7-lasI生物被膜形成能力和运动性显著降低(P＜0.01),但其生长特性和耐药性无显著变化(P＞0.05);Real-time PCR检测结果表明,重组菌株的毒力因子fimH转录水平上调了 58.8倍,而 ompA 、iss分别下调了 95.4％、77.3％.与生物被膜形成相关基因 agn43 下调了 75％,鞭毛合成基因flhA下调了 80.8％.此外,AHL受体 sdiA的转录水平上调了 19.8倍.[结论]转化 lasI至 APEC中,能促进其在 APEC中合成信号分子 AHL,并显著影响 APEC的部分生物学特性,为进一步探讨AHL型群体感应系统对 APEC的调拉作用提供参考.

目的 探究铜绿假单胞菌生物膜和浮游菌状态下毒力因子的表达差异.方法 使用铜绿假单胞菌标准菌株PAO1,分别在生物膜(静置)和浮游菌(摇床)状态下培养,收集上清液,检测总蛋白酶、LasA和LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素、溶血活性;通过荧光定量PCR检测群体感应(quorumsensing,QS)系统相关基因的表达;同时,通过活菌计数检测PAO1在生物膜和浮游菌状态下的生长曲线.结果 生物膜状态下,铜绿假单胞菌PAO1的总蛋白酶、LasA、LasB弹性蛋白酶、鼠李糖脂、绿脓素表达均增高(均P＜0.05),溶血活性增高(P＜0.05),生物膜和浮游菌状态下细菌生长曲线差异无统计学意义,QS相关基因rhlI、rhlR、rhlA、lasI、lasR、pqsA、pqsR表达增高(均P＜0.05).结论 铜绿假单胞菌PAO1在生物膜状态下毒力因子表达较浮游菌状态下增高.

目的:探索黄连解毒汤铜对绿假单胞菌生长与毒力因子的干预作用.方法:将铜绿假单胞菌分别与不同浓度梯度的黄连解毒汤、黄连、黄柏、黄芩、栀子共同培养,观察对细菌生长、毒力因子、生物膜的影响.倍比稀释法观察黄连解毒汤对细菌生长的影响.刚果红弹性蛋白降解试验检测弹性蛋白酶活性,氯仿盐酸法测定绿脓菌素分泌量,结晶紫染色法观察生物被膜起始量,荧光定量PCR检测细菌密度感应(QS)基因转录水平.结果:黄连解毒汤最低抑菌浓度(MIC)为12.5 mg·ml-1,黄连、黄芩、黄柏均为25mg· ml-1,栀子为50mg· ml-1.黄连解毒汤和黄连抑制绿脓菌素最低浓度均为6.25 mg·ml-1,黄芩与黄柏为12.5 mg·ml-1,栀子为50 mg· ml-1.黄连解毒汤抑制弹性蛋白酶最低浓度为6.25 mg·ml-1,黄连与黄柏均为12.5 mg·ml-1,黄芩和栀子均为25 mg·ml-1.黄连解毒汤抑制生物被膜的最低浓度为6.25 mg·ml-1,黄连和黄芩均为12.5 mg·ml-1,黄柏和栀子均为@@25 mg·ml-1.在低于最小抑菌浓度梯度之下,6.25 mg·ml-1黄连解毒汤和12.5 mg·ml-1黄连抑制lasB、lasI、lasR、rhlI、rhlR基因转录,12.5 mg·ml-1黄岑和25.0 mg·ml-1栀子抑制lasB和lasI基因转录,12.5 mg·ml-1黄柏抑制lasB和rhlI基因转录.结论:黄连解毒汤4种组分通过协同作用对细菌生长和密度感应系统调控的毒力因子发挥抑制作用.

多种植物精油及其活性成分被证明具有群体感应(quorum sensing,QS)抑制活性,可以通过抑制病原菌的QS系统,减弱甚至消除其毒性和致病性.探究香茅醛对铜绿假单胞菌PAO1 QS系统的抑制活性,研究香茅醛对QS调控的毒力基因和毒力因子的影响,对揭示香茅醛的作用机制有一定科学意义.改变香茅醛处理PAO1细胞的浓度与时间,观察其生长情况,测定生物被膜、绿脓菌素、弹性蛋白酶、Pseudomonas quinolone signal(PQS)信号分子的产量,以及用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测QS系统关键基因和相关毒力基因的表达水平.研究发现1.08 mg·mL-1香茅醛不抑制PAO1细胞的生长,但是显著下调了QS系统关键基因lasI、lasR、rhlI、rhlR、pqsA、pqsR和相关毒力基因lasA、lasB、pslA、phzM、toxA、chiC、lecB的表达.1.08 mg·mL-1香茅醛降低了PQS的产量,对生物被膜的抑制率达到54.4％.2.15 mg·mL-1香茅醛使PAO1细胞培养5 h和24 h时的弹性蛋白酶产量分别减少84.1％和71.6％.0.27 mg·mL-1香茅醛轻微刺激绿脓菌素产生,0.54、1.08和2.15 mg·mL-1香茅醛减少绿脓菌素的产量.总之,香茅醛对PAO1具有高效的QS抑制活性,能下调QS系统关键基因和相关毒力基因的表达水平,能抑制相关毒力因子的产生,有潜能开发为高效的群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitors,QSI).

目的:探讨1,3-丙二胺对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用及其潜在的作用机制.方法:将实验分为添加1,3-丙二胺的实验组和不添加1,3-丙二胺的对照组.利用结晶紫染色法检测1,3-丙二胺对铜绿假单胞菌生物膜的抑制作用,比较两组生物膜的形成量;通过初始黏附抑制试验和泳动平板试验检测1,3-丙二胺对铜绿假单胞菌初始黏附和泳动能力的抑制作用,比较两组的细菌初始黏附量和泳动的直径大小;通过蛋白质印迹法比较两组鞭毛蛋白Flagellin的表达;通过real-time RT-PCR比较两组铜绿假单胞菌群体密度感应系统相关基因和鞭毛调控相关基因的表达量;最后,通过分子对接试验检测1,3-丙二胺与靶蛋白LasI的相互作用.结果:与对照组相比,1.0 mmol/L 1,3-丙二胺实验组可使其生物膜的形成量相对值从1.708±0.089减少到1.288±0.080(t=6.07,P<0.01),且生物膜形成量的减少与1,3-丙二胺的浓度呈剂量依赖性;与对照组相比,实验组铜绿假单胞菌的起始黏附能力受到显著抑制,2.0 mmol/L 1,3-丙二胺实验组作用1 h即可使生物膜的黏附量从(0.890±0.389)×106 CFU/mL减少到(0.245±0.076)×106 CFU/mL(t=3.257,P<0.05);与对照组相比,2.0 mmol/L 1,3-丙二胺实验组还能显著抑制铜绿假单胞菌鞭毛介导的泳动能力,使其泳动圈直径从(1.840±0.144)cm减少到(0.756±0.222)cm(t=7.099,P<0.01).此外,蛋白质印迹法显示:与对照组相比,实验组的鞭毛蛋白Flagellin合成受到抑制,其蛋白质印迹条带明显变淡.分子对接试验表明1,3-丙二胺的潜在作用靶蛋白为LasI.结论:1,3-丙二胺可显著抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,其潜在作用靶点为LasI蛋白.