[目的]禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)不仅严重影响全球的养禽业,对人类公共健康也造成巨大的潜在威胁.pagP基因在细菌的抗菌肽抗性和致病性方面发挥重要作用,但关于pagP基因在APEC中的功能尚不清楚.本文构建禽致病性大肠杆菌pagP基因缺失株,对缺失株的抗菌肽抗性和致病性进行研究.[方法]利用Red重组系统构建APEC的pagP基因缺失株,然后利用回复质粒构建回复株.研究pagP基因对细胞黏附与入侵、生物被膜形成能力、外膜渗透性、抗菌肽敏感性、致病性等方面的影响.[结果]成功构建pagP基因缺失株和回复株,抗菌肽抗性试验发现pagP基因缺失株对多粘菌素B、鸡p-防御素2 (AVBD2)的敏感性显著增加(P＜0.01),致病性试验结果表明pagP基因缺失株的毒力显著降低(P＜0.01).[结论]APEC的pagP基因对AVBD2的敏感性和APEC的致病性密切相关,为深入研究pagP基因的功能及调控作用奠定了基础.

[目的]LuxS/AI-2型密度群体感应系统产生的自诱导信号分子AI-2 (AI-2的产生需要luxS基因编码的LuxS蛋白参与)参与对细菌众多生理功能的调控.探讨luxS对不同血清型禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenicity Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响.[方法]本研究以APEC优势血清型APECO1 (O1血清型)、DE 17 (O2血清型)、E940 (O78血清型)及其相应luxS缺失株为研究对象,对野生株和缺失株的生长特性、生物被膜形成、rdar (red,dry and rough)形态、运动性和耐药性等特性进行分析.[结果]luxS基因的缺失不影响APEC生长特性,但导致APEC不能产生AI-2;此外,luxS基因的缺失显著降低APECO1和E940的生物被膜形成(P＜0.05),而DE17的生物被膜形成无显著变化.对各菌株的rdar形态和运动性检测结果表明,luxS基因的缺失改变了APECO1的rdar形态,对DE17和E940并无影响;显著降低了APECO1和DE17运动能力,对E940并无影响.荧光定量PCR检测结果表明,luxS基因的缺失显著降低APECO1、DE17和E940与细菌运动性相关的鞭毛基因fliG和liI的转录水平(P＜0.05).此外,对各菌株的耐药性检测结果表明,luxS基因缺失导致APECO1对头孢吡肟和丁胺卡那由耐药变为高敏,同时对氯霉素与E940相同由高敏变为耐药,但对DE17的耐药性无显著改变.[结论]luxS对APEC的生物学特性具有重要的调控作用,且这种调控具有菌株特异性.

菌蜕(Bacterial ghosts)是一种只含有细菌内、外膜结构的细菌空壳,可作为新型疫苗和传递载体.本研究通过3种方式制备禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenicity Escherichia coli,APEC)分离株DE17的菌蜕,评价不同的菌蜕制备方法.结果表明,利用噬菌体PhiX174的裂解基因E构建的溶菌质粒pBV220-E制备DE17菌蜕,对DE17菌株裂解率可达99.9％,扫描电镜观测结果表明,在DE17两端或中部形成可见的跨膜孔道,呈现典型的菌蜕结构.利用合成的细胞穿透肽MAP (KLALKLALKALKAALKLA)作用于DE17制备菌蜕,结果表明,10 mol/L的MAP可实现对OD600=0.1的DE17完全灭活,扫描电镜虽未看到明显的跨膜孔道,但细菌的膜结构呈现沟壑状,而构建的可表达MAP的溶菌质粒pBV220-MAP并不能实现对DE17的裂解作用.本研究通过比较分析不同APEC菌蜕的制备方式,为进一步研究菌蜕疫苗和提高菌蜕疫苗的生物安全性提供参考.

目的 了解广西生鲜畜禽产品中致病性大肠杆菌血清型分布、耐药性以及β-内酰胺酶bla TEM、bla CTX-M基因和氟喹诺酮类抗生素耐药基因qnrA、oqxA、oqxB、aac(6')-Ib-cr的流行情况.方法 采用玻片凝集法对2015—2016年间分离自广西生鲜畜禽产品中的249株致病性大肠杆菌进行"O"抗原血清型鉴定;K-B纸片法对已定型菌株进行24种常见抗生素的敏感性试验;PCR方法检测blaTEM、blaCTX-M、qnrA、oqxA、oqxB、aac(6')-Ib-cr.结果 249株致病性大肠杆菌中136株可定型、96株未定型、17株自凝,分别占鉴定菌株的54.6％、38.6％、6.8％;136株已定型菌株分属25个血清型,以O8(19.85％)、O86(8.82％)、O6(6.62％)、O28(6.62％)、O124(6.62％)为主要优势血清型;136株已定型菌株对24种抗生素均产生不同程度的耐药,耐药率从16.18％到100％,且全部为多重耐药,主要集中在12～18重耐药,共占多重耐药的72.06％;136株已定型菌株对6种耐药基因的检出率为qnrA 91.18％(124/136)、oqxA 80.88％(110/136)、oqxB 50.00％(68/136)、aac(6')-Ib-cr 35.29％(48/136)、blaTEM 100.00％(136/136)、blaCTX-M 23.53％(32/136).结论 广西生鲜畜禽产品源致病性大肠杆菌O抗原血清型呈多样性分布,耐药情况严重,临床日益严重的耐药现象与耐药基因的普遍存在有重要的关系.

本研究以禽致病性大肠杆菌(APEC)及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡小肠为模型,以分析其免疫相关基因的表达变化为目的,采用转录组测序(RNA-Seq)技术对感染APEC及其PhoP/Q缺失株的雏鸡小肠样本RNA进行测序,分析免疫相关基因的表达变化,结果为野生株攻毒组与对照组相比、野生株攻毒组与缺失株攻毒组相比、缺失株攻毒组与对照组相比,分别筛选出131、105、172个差异表达基因(fold change≥2,FDR≤0.05),GO功能分类结果显示分别有87、99、159个基因得到注释,这些基因主要富集到氧化还原过程、脂蛋白转运、血管内皮细胞迁移、免疫反应、凋亡过程负调控、肝素结合、铁离子结合、CCR趋化因子受体结合等功能,得出APEC及其PhoP/Q缺失株感染雏鸡后引起机体肠道免疫相关基因变化的结论,根据GO功能注释筛选出PTPRC、LCP1、YFV等免疫相关基因,为深入研究雏鸡肠道免疫提供依据.

[目的]双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等.本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响.[方法]采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异.[结果]rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强.凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降.细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响.动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力.荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高.[结论]RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力.

[背景]大肠杆菌病和沙门菌病是最常见的家禽细菌性疾病,给养禽业造成严重经济损失.另外,禽大肠杆菌和沙门菌也是重要的人畜共患病原菌,可通过禽类及其产品传播给人类,对人类健康造成严重威胁.加强禽大肠杆菌和沙门菌的快速鉴别检测,对养禽业和公共卫生都具有重要意义.[目的]建立禽大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测方法.[方法]通过比较分析确定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的特异靶标基因,设计5对特异性引物,通过条件优化建立多重PCR方法,分析该多重PCR方法的特异性、敏感性及可靠性.[结果]该方法能特异性地鉴定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,每个PCR反应的最低检出限分别为103 CFU细菌和100 pg基因组DNA.临床分离菌株检测显示,多重PCR与传统血清学方法结果一致.[结论]建立的多重PCR方法能够快速鉴别禽致病性大肠杆菌和不同血清型沙门菌,对禽大肠杆菌病和沙门菌病的流行病学调查及临床检测具有重要意义.

致病性大肠杆菌 O157 是重要的食源性致病微生物,O157:H7 是肠出血性大肠杆菌常见的血清型,是以食物为主要传播途径的致病菌,牛、羊、猪和鸡等家畜家禽是其主要宿主[1,2],该菌致病性强、致死率高,引起全世界广泛重视[3].溶源性作为温和噬菌体与宿主共存的一种现象广泛存在于自然界中.目前,物理或化学的方法是诱导溶源状态的噬菌体进入裂解周期的重要手段.国内外学者曾利用丝裂霉素C(MMC)诱导溶源性嗜盐古生菌及溶源性单增李斯特菌产生噬菌体[4,5],但对溶源性大肠杆菌 O157 诱导的具体方法探讨较少,本研究利用丝裂霉素C作为溶源状态噬菌体的诱导剂,设定不同的浓度梯度和时间梯度,具体讨论从大肠杆菌O157中诱导产生噬菌体的条件及方法,并对诱导后的噬菌体基因组进行初步鉴定,为今后从溶源性大肠杆菌 O157中诱导噬菌体提供方法.

[背景]禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽的大肠杆菌病,严重危害养禽业.Ⅴ型分泌系统(Type Ⅴ secretion system,T5SS)在APEC感染过程中发挥重要作用.[目的]分析不同致病型大肠杆菌的T5SS在APEC中的分布规律,探讨T5SS与APEC的大肠杆菌进化分群及其他毒力因子的关联性.[方法]根据大肠杆菌的15个T5SS序列设计特异性引物,采用PCR检测T5SS在APEC临床分离株中的分布;分析APEC菌株的系统进化分群及毒力因子分布,探讨T5SS分布和APEC系统进化分群及毒力因子的相关性.[结果]T5SS在APEC临床分离株中广泛分布,其中ydeK和pplfP的分布率最高,分别为98.55％和92.03％;而upaC和pic的分布率均低于10％.系统进化分群结果显示,APEC主要属于A、B1和D进化分群,B2群较少;T5SS分布和进化分群分析发现ehaA、ehaB、pic、vat在D进化分群APEC菌株中分布率较高,而ehaG、ag43/flu、apaC主要分布于A及B1群APEC中.然而,T5SS和APEC其他毒力基因分布无明显的关联性.[结论]T5SS广泛存在于APEC分离株中,且部分T5SS分布与大肠杆菌系统进化分群存在关联性.

[背景]禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是禽类主要病原菌之一,群体感应(Quorum sensing,QS)系统可通过信号分子调控其生物学特性.在 APEC中信号分子 AHL对其生物学特性的影响目前尚不清楚.[目的]研究信号分子 AHL对 APEC生物学特性的影响.[方法]将含铜绿假单胞菌酰基高丝氨酸内脂合成酶(Acyl-homoserine-lactone synthase,lasI)基因的表达质粒转化至 APEC菌株DE17中,构建重组菌株 DE17-lasI,利用 LasI在 DE17中合成AHL.比较野生株和重组菌林产生 AHL信号分子、生长特性、生物被膜形成能力、运动性以及耐药性等生物学特性的差异;运用 Real-time PCR技术,比较野生株和重组菌林中与生物被膜形成、运动性以及毒力因子相关基因的转录水平.[结果]对重组菌株 AHL信号分子检测表明,DEI7-lasI能够产生 AHL信号分子,与野生株 DE17相比,DEI7-lasI生物被膜形成能力和运动性显著降低(P＜0.01),但其生长特性和耐药性无显著变化(P＞0.05);Real-time PCR检测结果表明,重组菌株的毒力因子fimH转录水平上调了 58.8倍,而 ompA 、iss分别下调了 95.4％、77.3％.与生物被膜形成相关基因 agn43 下调了 75％,鞭毛合成基因flhA下调了 80.8％.此外,AHL受体 sdiA的转录水平上调了 19.8倍.[结论]转化 lasI至 APEC中,能促进其在 APEC中合成信号分子 AHL,并显著影响 APEC的部分生物学特性,为进一步探讨AHL型群体感应系统对 APEC的调拉作用提供参考.