目的:建立及优化检测立克次体目中7种重要病原菌的TaqMan-探针实时荧光定量PCR（qPCR）方法，可同步检测并明确感染类型。方法:根据普氏立克次体、莫氏立克次体和斑点热群立克次体 ompB基因、恙虫病东方体 groEL基因、查菲埃立克体16S rRNA基因、嗜吞噬细胞无形体 gltA基因和贝氏柯克斯体 com1基因序列合成引物和探针，优化反应体系及反应程序至同一方案，对该方法灵敏度、特异性和重复性等进行评价，并使用该方法对模拟样本和实际样本进行检测。 结果:7种病原菌标准曲线的 Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（均 R2>0.990 0），所建立方法最低检测限均为1×10拷贝数/μl且具有良好的特异性。96份蜱虫核酸提取物样本中，1份样本检出贝氏柯克斯体，3份样本检出斑点热群立克次体；80份不明原因发热患者血标本DNA中，1份样本检出恙虫病东方体，2份样本检出斑点热群立克次体。 结论:本研究基于TaqMan-探针qPCR方法，将7种病原菌反应体系及反应程序优化至同一方案，克服目前不同立克次体目病原菌采用不同的反应体系和反应程序的缺点，可将临床样本中立克次体目的7种重要病原菌精确定位检测至种，明确感染病原菌类型并缩短检测时间，有助于对患者的精准诊治。

目的 探讨关于斑点热立克次体的临床诊断及流行病学调查而进行的诊断方法学研究.方法 构建R.Japonica Anhui 120 strain OmpB原核表达质粒,表达、鉴定并纯化重组蛋白,用其作为抗原建立间接ELISA检测方法,检测120份临床样本中日本斑点热立克次体特异性IgG抗体,并评价方法的敏感性和特异性.结果 获得了高表达、高纯度的OmpB重组蛋白,建立的间接ELISA方法体系与美国食品和药物管理局认可的诊断试剂盒相比有良好的特异性和敏感性,两者的特异性为100％,敏感性为96.7％,符合率为99.2％,Kappa值为0.98.结论 OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性,能特异地检出斑点热立克次体IgG抗体,间接ELISA方法可作为临床诊断的技术储备及流行病调查和科学研究.

目的 了解淮安市南部丘陵地区寄生蜱中携带立克次体的分子流行特征,为立克次体病的防治提供依据.方法 采集宿主(羊、牛、犬)体表寄生蜱,形态学鉴定蜱虫种类,然后通过PCR扩增立克次体的外膜蛋白B基因(ompB),对立克次体ompB基因进行测序和生物信息学分析.结果 共调查210只(头)宿主动物,蜱携带率为31.43％(66/210).捕获的83只蜱经形态学鉴定均为长角血蜱.PCR检测发现长角血蜱中立克次体的感染率为3.61％(3/83).ompB基因G+C平均含量36.43％,平均核苷酸多样性(Pi)为0.00535.3株立克次体分离株ompB基因序列之间的一致性很高,并与GeneBank中立克次体属斑点热群立克次体R.hulinensis(AY260452.1)的同源性最高,分别为98.1％、97.6％和97.5％.结论 淮安市南部丘陵地区寄生蜱中存在斑点热群立克次体感染,应制定防控措施,以免危害动物及人类健康.

为了建立4类常见致病性立克次体的快速检测方法, 本研究根据斑疹伤寒群立克次体lgtD基因、斑点热群立克次体ompB基因、恙虫病东方体TSA56基因和贝氏柯克斯体23S rRNA基因序列设计引物和探针, 以克隆的基因片段作为DNA 模板, 建立4模块实时荧光定量 PCR 检测方法, 用不同立克次体和细菌菌株核酸样本评价该方法的特异性和灵敏度.结果显示, 4个模块标准曲线的循环阈值 ( Ct) 与模板拷贝数均呈良好的线性关系, 并且在检测相应的立克次体核酸样本时具有良好的灵敏度、特异性和重复性, 适合于快速检测样本中微量立克次体DNA, 可用于临床实验室快速确诊立克次体疾病.

目的 了解四川省石渠县牦牛体表寄生蜱的种类及其斑点热群立克次体的感染情况.方法 采集牦牛体表的蜱,经形态学初步鉴定后,提取蜱总DNA,PCR扩增蜱16S rRNA基因及斑点热群立克次体ompA、ompB基因,并对扩得阳性产物进行测序和构建进化树分析,从而确定蜱及其携带斑点热群立克次体的种类.结果 在石渠县4个乡共采集到蜱818只,其中西藏革蜱占78.97％(646/818)、青海血蜱占21.03％(172/818).在818只蜱中有408只扩得斑点热群立克次体ompA、ompB基因,总阳性率为49.8％.经比对分析,ompA基因总共得到4条序列(uncultured Rickettsia sp.shiqu1、R.rao-ultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3和R.raoultii.shiqu4),ompB基因也得到4条序列(uncultured Rickettsia sp.shiqu1、R.raoultii.shiqu2、R.raoultii.shiqu3和R.raoultii.shiqu4).经遗传进化分析显示ompA基因的uncultured Rickettsia sp.shiqu1与我国青海未定种的Uncultured Rickettsia sp.(MG228270)亲缘关系最近;ompB基因的uncultured Rickettsia sp.shiqu1与韩国未定种的Rickettsia sp.(KC888953)和Candidatus Rickettsia longicornii(MG906675)亲缘关系最近;ompA和ompB基因的R.raoultii.shiqu2-4与对人有致病性的劳氏立克次体(R.raoultii)的亲缘关系最近.结论 首次在牦牛体表寄生的西藏革蜱中检出劳氏立克次体.石渠县存在西藏革蜱和青海血蜱,蜱传劳氏立克次体感染率较高并且具有感染人的风险.

目的 对从我国临床患者血液中新发现和分离出的日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白进行系统的结构与功能预测,为深入了解其在立克次体致病机制中的作用、研发斑点热临床诊断试剂和疫苗提供理论基础.方法 基于日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码的氨基酸序列,应用生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性等性质和可能的B细胞抗原表位.结果 日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因在3297～3311处存在连续15个碱基的缺失,除此之外,该分离株还有4个碱基突变.该基因编码的氨基酸数目为1651个,蛋白质分子量为167.69 ku,共由20种氨基酸组成,其中含量较多的氨基酸是Gly;理论等电点pI为5.15,消光系数为58805或58680,蛋白不稳定指数为7.15,脂肪指数为88.86,总平均亲水性(GRAVY)为0.06,为疏水性蛋白;Sig-nal peptide(Sec/SPI)Likelihood为0.5677,有信号肽序列;存在一个Pfam区域和自转运体区,分别与细菌黏附宿主和蛋白质转运有关;蛋白二级结构中以无规卷曲为主,其次为β-折叠和 α-螺旋,分别占到53.73％、30.83％和15.45％.同源模建蛋白的三级结构中,第1308～1651氨基酸部分在蛋白表面形成桶状结构,可能具有丝氨酸蛋白酶的作用;蛋白分子内抗原表位较丰富,共有159个可能的抗原表位,预测分数最高(0.94)的为1269～1284位序列.结论 成功分析和预测了日本斑点热立克次体安徽120株ompB基因及其编码蛋白的组成、蛋白质的二级结构、三级结构和B细胞抗原表位,为研究日本斑点热立克次体的致病机制、临床诊断试剂和亚单位疫苗的研发提供了理论支持.

参照立氏立克次体分子量为12×10 4蛋白基因序列合成引物，分两段扩增日本立克次体的12×10 4蛋白基因，扩增DNA的长度分别为2.5和2.6kb。含有启动子区的2.6kb片段在pUC19质粒中不稳定。从这段DNA删去启动子及85个氨基酸编码子区的扩增产物可被克隆。以这一重组质粒为载体克隆含终止密码子的2.5kb片段。序列分析表明开放阅读框架由4956核苷酸对组成，编码1652个氨基酸。日本立克次体与立氏立克次体ompB基因的遗传同源性是95.5%，表明分子量12×10 4可能被用于制备抗斑点热立克次体感染的亚单位疫苗。