目的 探究配对盒家族基因(PAX)1 检测在子宫颈癌(CC)筛查及预后判定中的临床价值及相关分子机制.方法 选择赣州市妇幼保健院CC患者 90 例,取其肿瘤组织;纳入同期于医院进行治疗的宫颈上皮内瘤样病变(CIN)患者74 例,并取其CIN组织;纳入同期于医院实施子宫全切除术的患者 45 例,取其正常宫颈组织.比较 3 组不同宫颈组织PAX1甲基化指数(PMR)及蛋白阳性表达率,并分析PAX1 基因甲基化对CC筛查及预后评估的效能.选择正常宫颈细胞系ECT1/E6 E7 及宫颈癌细胞系Hela,比较两种细胞系PAX1 mRNA及蛋白表达水平;将Hela细胞分为空白对照组(不进行处理常规培养)、PAX1 mimics NC组(转染PAX1 mimics NC)、PAX1 mimics组(转染PAX1 mimics)、PAX1 inhibition NC组(转染PAX1 in-hibition NC)、PAX1 inhibition 组(转染PAX1 inhibition),观察各组细胞增殖、侵袭及迁移能力,并进一步比较各组细胞Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关分子[上皮钙依赖黏附蛋白(E-cadherin)、β-catenin]mRNA及蛋白表达水平.结果 正常宫颈、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ组织中PAX1 PMR值均较CC组织显著降低(P<0.05);CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ组织中PAX1 PMR值均较正常宫颈组织显著升高,且随CIN分级增加而明显升高(P<0.05).PAX1 甲基化诊断CC的曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度分别为 0.97、93.20%、62.25%.正常宫颈、不同CIN组织PAX1 阳性表达率均较CC组织显著升高(P<0.05);CINⅡ、CIN Ⅲ组织PAX1 阳性表达率均较正常宫颈组织显著升高(P<0.05).PAX1 蛋白诊断CC患者预后的AUC、灵敏度、特异度分别为 0.829、90.00%、62.40%.Hela细胞系PAX1 mRNA及蛋白表达水平较ECT1/E6 E7 细胞系显著降低(P<0.05).在24、48、72 h时,PAX1 mimics组细胞增殖能力较空白对照组显著降低(P<0.05);PAX1 inhibition 组细胞增殖能力较空白对照组显著升高(P<0.05).PAX1 mimics组细胞迁移、穿膜数、β-catenin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著降低,E-cad-herin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著升高,E-cadherin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著降低(P<0.05);PAX1 inhibition组细胞迁移、穿膜数、β-catenin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著升高(P<0.05).PAX1 mimics组β-catenin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著降低,E-cadherin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著升高(P<0.05);PAX1 inhibition组β-catenin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著升高,E-cadherin mRNA及蛋白表达水平均较空白对照组显著降低(P<0.05).结论 PAX1 检测在CC临床筛查及早期病情评估方面具有较高价值,且上调PAX1 表达可阻断CC细胞增殖、侵袭及迁移,其作用机制可能是通过调控Wnt/β-catenin通路实现的,可为PAX1 在CC靶向治疗提供理论依据.

目的:探讨长链非编码核糖核酸(LncRNA)KCNQ1OT1靶向调控miR-124-3p/高迁移率族蛋白B1(HMGB1)轴对高糖诱导肾小球系膜细胞(HMC)增殖、凋亡及纤维化的影响.方法:将人HMC分为对照组(NC组)、高糖组(30mmol/L葡萄糖)、阴性序列(si-NC)组、KCNQ1OT1 小干扰核糖核酸(RNA)(si-KCNQ1OT1)组、si-KCNQ1OT1+模拟对照序列(miR-NC)组、si-KC-NQ1OT1+miR-124-3p抑制剂(miR-124-3p inhibitor)组,各组在转染后进行高糖处理.实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测LncRNA KCNQ1OT1信使核糖核酸(mRNA)、miR-124-3p mRNA、HMGB1 mRNA表达;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白印迹法(Western blot)检测HMGB1蛋白、增殖相关蛋白[细胞周期蛋白1(Cy-clinD1)]、细胞凋亡蛋白[半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶蛋白9(caspase-9)]、细胞纤维化蛋白[纤维连接蛋白(FN)、细胞黏附分子-1(ICAM-1)]表达;双荧光素酶报告基因实验验证LncRNAKCNQ1OT1与miR-124-3p与HMGB1之间的靶向关系.结果:与NC组比较,高糖组KCNQ1OT1 mRNA、HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白、CyclinD1蛋白、FN蛋白、ICAM-1蛋白表达、HMC活性(24h、48h和72 h)明显上升,miR-124-3pmRNA、caspase-3蛋白及caspase-9蛋白表达、HMC凋亡率明显下降(P＜0.05);与高糖组、si-NC 组比较,si-KCNQ1OT1 组 KCNQ1OT1 mRNA、HMGB1 mRNA及HMGB1 蛋白、CyclinD1 蛋白、FN 蛋白、ICAM-1蛋白表达、HMC活性(24 h、48 h和72 h)明显下降,miR-124-3p mRNA、caspase-3蛋白及caspase-9蛋白表达、HMC凋亡率明显上升(P＜0.05);与 si-KCNQ1OT1 组、si-KCNQ1OT1+miR-NC 组比较,si-KCNQ1OT1+miR-124-3p inhibitor 组 HMGB1 mRNA 及 HMGB1 蛋白、CyclinD1 蛋白、FN 蛋白、ICAM-1 蛋白表达、HMC 活性(24 h、48 h 和 72h)明显上升,miR-124-3pmR-NA、caspase-3 蛋白及caspase-9蛋白表达、HMC凋亡率明显下降(P＜0.05).较miR-NC组与KCNQ1OT1-WT共转染组而言,miR-124-3p mimic组与KCNQ1OT1-WT共转染组细胞荧光素酶活性明显降低(P＜P0.05);较miR-NC组与HMGB1-WT共转染组而言,miR-124-3pmimic组与HMGB1-WT共转染组细胞荧光素酶活性明显降低(P＜0.05).结论:LncRNA KCNQ1OT1可以靶向下调miR-124-3p mRNA表达,上调HMGB1 mRNA及HMGB1蛋白表达,促进高糖诱导HMC增殖,抑制凋亡,促进细胞纤维化发展.

目的 探讨喉鳞状细胞癌(LSCC)组织中CLDN1基因启动子的甲基化水平及其临床意义.方法 采用实时荧光定量甲基化特异性聚合酶链反应(qMSP)分别检测91例LSCC患者的LSCC组织及其配对的癌旁正常组织CLDN11基因启动子甲基化水平,分析其与临床病理特征及预后的关系,绘制ROC曲线评估其诊断价值.结果 LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平明显高于癌旁正常组织(P＜0.01).Ⅲ、ⅣV期、T3～4期、有淋巴结转移的LSCC组织CLDN11基因启动子甲基化水平分别高于Ⅰ、Ⅱ期、T1～2期、无淋巴结转移的LSCC组织(均P＜0.01).ROC曲线分析AUC为0.884(95％CI:0.835～0.932,P＜0.01),甲基化水平为0.571时,诊断LSCC的灵敏度、特异度分别为0.923、0.736.与低甲基化组(甲基化水平＜0.571)患者相比,高甲基化组(甲基化水平≥0.571)患者总生存率较低(P＜0.01).结论 CLDN11基因启动子高甲基化或可作为LSCC诊断和预测预后的生物标志物.

目的 构建mmu-miR-155真核过表达载体pmR-155,探讨其在乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠中对HBV复制及PTEN基因表达的调控作用. 方法 PCR扩增mmu-miR-155的前体基因片段(pre-mmu-miR-155),双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过菌落PCR、双酶切和测序验证重组载体的准确性.将重组载体采用高压尾静脉法注入HBV转基因小鼠体内作为实验组,同时设空质粒组(注入pmR-mCherry空质粒)、空白组(注入等体积磷酸盐缓冲液),7d后qPCR检测各组细胞miR-155的表达情况,14d采用酶联免疫吸附法检测干扰素(IFN)γ表达量;1个月后qPCR检测肝内细胞因子信号抑制物(SOCS)1、PTEN基因mRNA表达量及Western blot检测肝内SOCS1、PTEN、HBX蛋白表达水平.两组数据比较采用独立样本t检验;三组数据比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD法. 结果 经菌落PCR、双酶切和测序证实,pre-mmu-miR-155基因片段成功插入pmR-mCherry载体中.注入质粒7d后,实验组表达miR-155的水平明显升高(t=8.90,P＜0.01);注入质粒14 d后,实验组IFN γ表达量较空白组升高(F=26.58,P＜0.01);注入质粒30 d后,实验组肝内SOCS1、PTEN mRNA (FSOCSI mRNA=19.72,P＜ 0.01;FPTEN mRNA=7.38,P＜0.05)及蛋白表达水平(FSOCS1=50.30,P＜0.01;FPTEN=129.00,P＜0.01)均下降,同时HBX表达水平下降(FHBX=77.97,P＜ 0.01). 结论 成功构建mmu-miR-155真核过表达载体pmR-155,该重组载体可稳定表达mmu-miR-155;miR-155可以通过下调SOCS1表达,进而促进IFN γ的表达,增强HBV转基因小鼠的抗HBV能力.与此同时,miR-155可下调PTEN的表达,有潜在的促进肝癌发生的可能.

目的:探讨对氧磷酶1(paraoxonase1,PON1)基因启动子区甲基化水平和端粒长度与中国山东地区汉族人群脑梗死发病的相关性.方法:选取152例确诊脑梗死患者为病例组,152例健康人为对照组,提取外周静脉血基因组DNA,使用荧光定量甲基化特异性PCR(quantitative methylationspecific PCR,qMSP)测定受试者的血液PON1基因启动子甲基化水平及端粒长度.每个样本的甲基化程度以甲基化参考百分比(PMR)来表示.结果:病例组中PON1甲基化程度显著高于对照组(Z=-3.898,P=0.0001),性别亚组显示差异主要在男性中更为显著(Z=-3.786,P=0.0002).病例组患者的端粒长度显著低于对照组(Z=-11.843,P＜0.0001),且男女亚组中端粒长度均显著低于对照组(P＜0.05).然而,并没有发现PON1甲基化水平与端粒长度的相关性(病例组r=0.023,P=0.775;对照组r=-0.157,P=0.054).结论:PON1启动子区高甲基化和端粒长度变短与脑梗死发病相关,是中国山东地区汉族人群脑梗死发病的危险因素.

目的:研究影响苯达莫司汀联合利妥昔单抗(BR)治疗边缘区淋巴瘤(MZL)疗效的相关临床因素和分子特征.方法:回顾性分析2020年3月-2021年9月上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科收治的48例MZL患者的临床资料,初治患者29例,复发/进展患者19例,均应用BR方案(利妥昔单抗375 mg/m2,d0,苯达莫司汀90 mg/m2,d1～2)进行治疗.48例患者中有36例进行了 DNA测序,以进一步探究基因突变对MZL患者中BR方案疗效的影响.结果:48例患者中位年龄65.5(22.0～79.0)岁,男女比例1.5:1.0.29例初治患者中,20例达完全代谢学缓解(CMR),8例达部分代谢学缓解(PMR),CMR率69.0％(20/29),总有效率(ORR)96.6％(28/29).19 例复发/进展患者中,13 例达 CMR,4 例达 PMR,CMR 率 68.4％(13/19),ORR 89.5％(17/19).中位随访12(6～24)个月,初治患者1年疾病无进展生存(PFS)率为96.2％,1年总生存(OS)率为100.0％;复发/进展患者1年PFS率为100.0％,1年OS率为100.0％.进一步分析发现,MZL的起源部位[黏膜相关淋巴组织MALT淋巴瘤(胃、肺、其他)、脾边缘区淋巴瘤、结内边缘区淋巴瘤]、既往是否接受过治疗、肿块直径＞7.5 cm、多个结外器官受累、骨髓受累、IPI评分3～5分、β2微球蛋白(β2-MG)升高、免疫固定电泳阳性,FISH-MALT1阳性均对患者的CMR率无显著影响(P≥0.05).36例患者的DNA测序结果显示,其中20例(20/36,55.6％)MZL患者至少检出一个基因突变.肿瘤基因突变通路对患者的CMR率无显著影响(P≥0.05).安全性方面,血液学不良反应以中性粒细胞减少、血小板减少和贫血为主,非血液学不良反应以恶心、呕吐和皮疹为主.结论:不论是初治还是复发/进展的MZL患者,BR方案均有确切的临床疗效,患者耐受性良好.本研究为单中心回顾性研究,还需要前瞻性大样本量的临床研究来验证.

目的:pmr1基因编码P型钙转运ATP酶Pmr1,参与维持细胞壁完整性和调控胞质分裂.以粟酒裂殖酵母为模式细胞,探究pmr1缺失后对细胞有性生殖及细胞分裂中肌动蛋白环精细动力学的影响,揭示pmr1缺失后细胞异常生长过程中的关键基因和代谢通路.方法:通过细胞生长速率测定、产孢统计、绿色荧光蛋白标记肌动蛋白和活细胞成像的方法,检测pmr1缺失对细胞有丝分裂和有性生殖的影响;采用RNA-Seq对野生型菌株和pmrlΔ菌株测序和生物信息学分析,并进行qRT-PCR验证.结果:pmr1缺失后细胞生长减慢,分裂期细胞长度减小,子囊孢子长度增加,且肌动蛋白环的形成时间增加.RNA测序结果显示,mfm1、mfm2和mat1-Mc下调,错配修复通路cdc1和exo1上调以及糖酵解/糖异生途径pgi1、pfk1和dld1下调是引起pmr1 Δ孢子长度增加的主要因素;糖酵解/糖异生途径tdh1、pgk1下调,以及脂肪酸合成代谢途径fas1、fas2、cut6和lcf1下调导致了 pmr1Δ分裂期细胞长度减小;hsp9上调是影响pmr1Δ收缩环形成时间增加的关键基因.qRT-PCR实验证实,pmr1缺失后关键基因的表达趋势与RNA-Seq结果一致.结论:pmr1缺失后,粟酒裂殖酵母细胞中错配修复通路、糖酵解/糖异生途径及脂肪酸合成代谢途径发生障碍,导致细胞及孢子形态均异常,且肌动蛋白环形成受阻,细胞增殖减缓.

目的 探讨miR-204启动子甲基化在结直肠癌(CRC)中的临床意义.方法 收集2018年1月至2020年3月于我院就诊的69例CRC患者血浆样本、肿瘤组织标本和癌旁正常结肠黏膜组织标本;另外招募68例健康志愿者作为正常对照组,采集血浆样本.使用肿瘤基因图谱计划(TCGA)数据库与基因芯片数据(Methyl450K)分析肿瘤和正常组织中识别的CpG位点的甲基化水平.采用定量甲基化特异性PCR法(qMSP)和实时荧光定量PCR法(qPCR)检测样本中miR-204启动子区甲基化状态和基因表达量.结果 TCGA数据表明miR-204表达与宿主基因TRPM3的表达协调下调,并确定了miR-204启动子周围的两个CpG岛.与癌旁组织比较,CRC组织中miR-204启动子甲基化参考百分比(PMR)升高[1.78(0.35,16.61)vs.1.51(0.45,2.98),P<0.001],且与miR-204表达量呈负相关(r=-0.324,P=0.007),与DNA甲基转移酶1 mRNA呈正相关(r=0.502,P<0.001).此外,与正常对照组比较,CRC患者血浆cfDNA中miR-204启动子PMR显著升高[6.57(0.76,12.45)vs.1.60(0.59,3.4),P=0.015],并且与CRC组织miR-204启动子PMR呈正相关(r=0.418,P<0.001).血浆cfDNA中miR-204启动子PMR用于CRC的诊断的受试者工作特征曲线下面积为0.701(95％CI:0.610～0.791),灵敏度和特异度分别为56.5％和94.1％.此外,进一步依据临床分期、分化程度等进行分层分析,并未观察到miR-204启动子超甲基化与CRC患者主要临床特征的关系(P>0.05).结论 miR-204启动子甲基化与CRC显著相关,并且血浆cfDNA中miR-204启动子甲基化状态或可作为CRC诊断和监测的潜在生物标记物.