目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象，利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO，通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异，初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法:在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA)，寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组，慢病毒包装系统转染293T细胞，收集纯化病毒感染K562细胞，嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆，有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO，Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株，同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL)，采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果:成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体，转染293T细胞后，利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比，K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱，IM药物敏感性显著增强，细胞凋亡进程显著加快(均 P<0.05)。 结论:利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株，TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。

目的:应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法:选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×10 13 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。 结果:Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义( P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。 结论:AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

目的:通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建HMGB2基因敲除的小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)，并验证肺炎克雷伯菌(KP)感染后HMGB2敲除细胞介导促炎因子产生和杀菌能力的变化。方法:针对小鼠HMGB2基因靶向设计向导RNA(sgRNA)，将插入sgRNA的pX459质粒转染Raw264.7细胞，利用抗性筛选和有限稀释法获得HMGB2基因敲除细胞克隆。利用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)对所获细胞克隆的HMGB2基因和蛋白表达进行鉴定。通过细菌计数测定HMGB2 －/－ Raw264.7吞噬和杀伤细菌能力，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定HMGB2 －/－ Raw264.7促炎因子分泌情况。组间比较采用 t检验。 结果:利用嘌呤霉素成功筛选出单克隆细胞株，HMGB2蛋白在敲除细胞株中完全不表达，HMGB2敲除后对KP的吞噬与正常细胞比较，差异无统计学意义(2.37±0.31比2.33±0.15， t＝0.17， P>0.05)，但感染后18 h胞内细菌存活比例显著高于正常细胞[(67.67±9.02)%比(32.33±6.11)%， t＝5.62， P<0.01]；KP感染HMGB2 －/－ Raw264.7，促炎因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β和IL-6分泌量显著低于正常细胞[(54.00±18.08) pg/ml比(111.70±8.50) pg/ml， t＝5.00， P<0.01；(65.67±9.87) pg/ml比(128.00±30.61) pg/ml， t＝3.36， P<0.01；(72.67±9.07) pg/ml比(95.00±5.29) pg/ml， t＝3.68， P<0.05]。 结论:通过CRISPR/Cas9技术成功构建HMGB2基因敲除Raw264.7细胞株，验证了HMGB2对诱导相关炎性因子及抗KP感染的影响。

目的:探讨长链非编码RNA(LncRNA)LOC101927476在卵巢癌细胞中的表达及其对卵巢癌生物学特征的影响。方法:选取2018—2019年于中国医学科学院肿瘤医院手术治疗的卵巢癌患者。采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测卵巢癌细胞系3AO、OVCA429、TOV21G、A2780、SKOV3以及22例卵巢癌原发瘤和转移瘤组织中LncRNA LOC101927476的表达水平，采用TCGA数据库中卵巢癌转录组测序数据验证LncRNA LOC101927476和GATA4的表达，采用慢病毒包装体系构建过表达LOC101927476(OE-LOC101927476组)和空载(OE-EV组)慢病毒并转染至3AO细胞。设计单链向导RNA(sgRNA)，利用CRISPR/Cas9构建LncRNA LOC101927476敲除细胞系。采用Transwell法和划痕实验检测LncRNA LOC101927476对卵巢癌细胞侵袭和转移能力的影响。采用细胞计数盒8(CCK-8)法检测细胞的增殖能力。结果:real-time PCR显示，22例卵巢癌患者中，20例转移灶中LncRNA LOC101927476的表达水平低于原发灶。Transwell迁移实验显示，OE-EV组3AO细胞的穿膜细胞数为(1 024±76)个，高于OE-LOC101927476组[(699±65)个， P＝0.003]；sg-Control组OVCA429细胞的穿膜细胞数为(363±27)个，低于sg-LOC101927476组[(472±40)个] ，差异有统计学意义( P＝0.011)。Transwell侵袭实验显示，OE-EV组3AO细胞的穿膜细胞数为(661±95)个，高于OE-LOC101927476组[(357±63)个]，差异有统计学意义( P＝0.006)；sg-Control组OVCA429细胞的穿膜细胞数为(309±13)个，低于sg-LOC101927476组[(512±72)个] ，差异有统计学意义( P＝0.005)。划痕实验显示，培养48 h时，OE-LOC101927476组3AO细胞的划痕愈合比例为(10.86±0.63)%，低于OE-EV组[(57.38±4.42)%]，差异有统计学意义( P＝0.009)；培养24 h时，sg-LOC101927476组OVCA429细胞的划痕愈合比例为(59.98±1.34)%，高于sg-Control组[(23.15±2.03)%]，差异有统计学意义( P＝0.004)。CCK-8结果显示，OE-LOC101927476组3AO细胞的增殖能力明显减弱，在过表达LncRNA LOC101927476后第4天时，OE-LOC101927476组3AO细胞的吸光度( A)值为2.07±0.08，与OE-EV组(2.29±0.04)比较，差异有统计学意义( P＝0.009)。sg-LOC101927476组OVCA429细胞的增殖能力提高，在敲降LncRNA LOC101927476的表达后第4天时，sg-LOC101927476组OVCA429细胞的 A值为(2.13±0.03)，与sg-Control组(1.93±0.03)比较，差异有统计学意义( P＝0.001)。OE-LOC101927476组3AO细胞中GATA4的相对表达水平为1.86±0.25，与OE-EV组(1.00±0.00)比较，差异有统计学意义( P＝0.001)。在LncRNA LOC101927476高表达的患者中，GATA4的表达水平为(2.93±0.35)，高于LncRNA LOC101927476低表达的患者(0.29±0.06)，差异有统计学意义( P＝0.001)。 结论:LncRNA LOC101927476能够抑制卵巢癌的侵袭、迁移和增殖。

目的:利用CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2，HSV-2)。方法:利用CRISPR/Cas9技术对外源基因EGFP插入HSV-2基因组的策略进行探索，设计如下4种插入策略：(1)经典的同源重组修复模式，即环状双侧同源臂供体介导的基因敲入；(2)线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入；(3)同源性非依赖介导的基因敲入；(4)利用稳表达Cas9和sgRNA的细胞株，进行环状双侧同源臂供体介导的基因敲入。结果:使用策略2、3和4均成功构建了携带EGFP的HSV-2，其中策略2的基因敲入效率最高，然后依次为策略3、策略4，策略1未观察到重组病毒的产生。蚀斑纯化后的重组病毒在7代内能稳定表达绿色荧光蛋白，并且和亲本株在Vero细胞上具有相似的生长特性。结论:线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入效率更高，敲除载体的稳转细胞株能够有效地提高同源重组修复机制介导的基因敲入效率。

目的:构建表达视觉系统同源框2( VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。 方法:根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计 VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。 结果:电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有 VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1- VSX2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。 结论:成功构建1株表达 VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

目的:探讨胰高糖素样肽-1（GLP-1）对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）状态下生长分化因子15（GDF15）表达的影响。方法:共对25例NAFLD合并2型糖尿病患者26周不同药物治疗后（利拉鲁肽组9例、西格列汀组8例、甘精胰岛素组8例）进行分析。收集治疗前后体重、体重指数（BMI）及血清GDF15水平，通过磁共振成像-质子密度脂肪含量测量肝内脂肪含量（IHL）。8周龄雄性C57BL/6小鼠进行12周高脂饮食喂养，采用随机数字表法分为高脂饮食（HFD）组（6只）、艾塞那肽组（GLP-1组）（6只），另设正常饮食对照组（6只），干预8周后收取肝脏组织。HepG2细胞用300 μmol/L棕榈酸钠（PA）处理，并予Exendin-4（浓度分别为0、1、20、100 nmol/L）干预，另设脱脂牛血清白蛋白对照组。使用lentiCRISPRv2-sgRNA载体构建稳定敲除GDF15的HepG2细胞，空载体转染的HepG2细胞作为阴性对照。转染的细胞用300 μmol/L PA处理，并予100 nmol/L Exendin-4干预。测定血清及细胞上清中GDF15蛋白水平及肝脏组织和HepG2细胞的GDF15 mRNA水平与甘油三酯（TG）含量。采用单因素方差分析、协方差分析、Pearson相关分析等进行统计学分析。结果:在NAFLD合并糖尿病人群中，西格列汀组和甘精胰岛素组血清GDF15水平在治疗前后无明显变化。而利拉鲁肽组在26周后血清GDF15水平为（920.3±265.4）pg/ml，比治疗前的（742.2±279.0）pg/ml明显升高，差异有统计学意义（ P=0.015）；体重、BMI、IHL明显下降（ P均<0.05）。利拉鲁肽组血清GDF15改变量与IHL改变量呈负相关（ r=-0.676， P=0.045）。GLP-1显著改善高脂饮食喂养小鼠的肝脏脂质沉积及炎症状态。与HFD组相比，GLP-1组小鼠肝脏组织GDF15 mRNA明显升高。GLP-1能改善PA诱导的HepG2细胞脂质沉积，并以剂量依赖的方式上调GDF15的表达与分泌。与阴性对照组相比，敲除GDF15显著削弱了GLP-1改善细胞TG蓄积及炎症状态。 结论:GLP-1可促进肝脏GDF15的表达与分泌，并改善NAFLD肝脏脂质沉积及炎症状态。

规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR associated protein，Cas9)组成的CRISPR/Cas9系统是大多数细菌和古细菌的一种免疫系统。该系统在动物模型构建、基因治疗和基因表达调控等众多领域发挥着强大的作用。但该系统的脱靶效应等原因所导致的效率低下和安全性问题一直是人们研究的重点。本文主要对CRISPR/Cas9系统从sgRNA、Cas9蛋白、递送系统、DSB修复通路、脱靶检测手段以及碱基编辑技术六个方面提高其编辑效率的改进方法进行综述。

目的:探讨microRNA-140（miR-140）是否有独立于其宿主基因WWP2的转录启动子，从而为骨性关节炎的治疗提供新的思路。方法:通过共转染CRISPR-dCas9-VP64和ACAN gRNA慢病毒的SW1353细胞验证软骨细胞特征性基因ACAN的转录水平。通过构建能稳定表达CRISPR-dCas9-VP64的SW1353细胞并结合多条sgRNA（single guide RNA, sgRNA/gRNA）、人类髋关节软骨RNA测序结果验证miR-140是否与WWP2基因共表达，是否有独立的转录启动位点。结果:共转染CRISPR-dCas9-VP64和ACAN gRNA慢病毒的SW1353细胞能显著提高软骨细胞特征性基因ACAN的转录水平。从基因水平、蛋白水平证实成功构建能稳定表达CRISPR-dCas9-VP64的SW1353细胞。通过人类髋关节软骨RNA测序结果设计多条WWP2 gRNA以及miR-140启动子gRNA。实时定量PCR结果显示miR-140的表达既受其宿主基因WWP2调控，同时也有其独立的转录位点。结论:运用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建稳定表达CRISPR-dCas9-VP64蛋白的SW1353细胞能极大减少实验中样本间的差异化，保证实验结果的一致性。结合多条gRNA证明了miR-140既与WWP2共表达，同时也受其独立的转录启动子调控转录。运用CRISPR-dCas9-VP64d-gRNA能单独调控miR-140的表达，同时其宿主基因的表达不受影响，有潜力作为新兴的基因治疗方法治疗骨性关节炎。