目的:比较不同扩增体系NK细胞生物学特性的差异以及治疗异基因造血干细胞移植后（allo-HSCT）白血病复发的疗效。方法:分别采用CD3/CD52单抗扩增法和饲养层细胞扩增法诱导供者来源NK细胞大量扩增，检测扩增前后NK细胞表型、因子分泌、细胞毒的变化规律；选取16例allo-HSCT后复发白血病患者，8例输注CD3/CD52单抗扩增NK细胞，8例输注饲养层细胞扩增NK细胞，观察患者的治疗反应和长期生存情况。结果:①与CD3/CD52单抗扩增体系相比，饲养层细胞扩增体系NK细胞纯度较高、NK细胞表面活化性受体DNAM-1及NKp30表达较高、抑制性受体CTLA-4表达较低，而两种NK细胞NKG2D/CD25/CD69/Trail/PD-1/TIM-3/TIGIT表达差异无统计学意义。②两种扩增体系NK细胞Ki-67指数均明显增加，以饲养层细胞扩增NK细胞尤为明显；饲养层细胞扩增NK细胞穿孔素及颗粒酶B表达水平均明显高于CD3/CD52单抗扩增NK细胞。③16例allo-HSCT后复发白血病患者NK细胞输注过程中均未观察到明显不良反应。NK细胞输注后中位随访时间为2554（917~2583）d，CD3/CD52单抗扩增组中3例患者无白血病存活，5例死亡；饲养层细胞扩增组中6例患者长期存活，2例死亡。5例患者在NK细胞输注前存在移植物抗宿主病，NK细胞输注后移植物抗宿主病未加重甚至缓解。结论:CD3/CD52单抗扩增与饲养层细胞扩增体系NK细胞的生物学特性具有明显差异；NK细胞输注对allo-HSCT后复发白血病患者的疗效仍需要进一步验证。

目的:选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象，利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO，通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异，初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法:在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA)，寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组，慢病毒包装系统转染293T细胞，收集纯化病毒感染K562细胞，嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆，有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO，Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株，同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL)，采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果:成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体，转染293T细胞后，利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比，K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱，IM药物敏感性显著增强，细胞凋亡进程显著加快(均 P<0.05)。 结论:利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株，TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。

目的:探讨糖原合成酶激酶3（GSK3）抑制剂对伊马替尼诱导的慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法:1 μmol/L伊马替尼分别联合不同浓度的GSK3抑制剂氯化锂（1.0、2.0、4.0 mmol/L）、SB216763（0.5、1.0、5.0 μmol/L）及TWS119（0.5、1.0、5.0 μmol/L）作用于K562细胞，分别以1 μmol/L伊马替尼为相应对照组。用CCK-8法检测细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡，蛋白质印迹法检测细胞内Wnt-β-catenin通路相关蛋白水平的变化。结果:1 μmol/L伊马替尼分别联合浓度梯度的SB216763、氯化锂、TWS1193组与对照组间K562细胞存活率差异均有统计学意义（均 P<0.01）。1 μmol/L伊马替尼+1.0 μmol/L SB216763组、1 μmol/L伊马替尼+ 5.0 μmol/L SB216763组细胞存活率分别为（73.6±3.0）%、（77.0±3.6）%，均较对照组细胞存活率[（68.0±2.8）%]高（均 P<0.05）；1 μmol/L伊马替尼+0.5 μmol/L SB216763组细胞存活率为（70.0±2.2）%，与对照组比较差异无统计学意义（ P>0.05）。1 μmol/L伊马替尼+2.0 mmol/L氯化锂组、1 μmol/L伊马替尼+4.0 mmol/L氯化锂组细胞存活率分别为（75.5±3.6）%、（83.4±3.9）%，均较对照组细胞存活率[（69.5±2.1）%]高（均 P<0.05）；1 μmol/L伊马替尼+1.0 mmol/L氯化锂组[（72.3±6.0）%]与对照组间细胞存活率差异无统计学意义（ P>0.05）。1 μmol/L伊马替尼分别联合0.5、1.0、5.0 μmol/L TWS119组细胞存活率分别为（70.0±1.1）%、（72.1±0.8）%、（73.8±0.7）%，均较对照组[（67.9±7.5）%]高（均 P<0.01）。1 μmol/L伊马替尼+5.0 μmol/L SB216763、1 μmol/L伊马替尼+4.0 mmol/L氯化锂、1 μmol/L伊马替尼+5.0 μmol/L TWS119三组细胞凋亡率分别为（18.16±3.59）%、（20.11±2.98）%、（16.27±2.36）%，均较对照组[（28.26±2.20）%]低，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。与单独伊马替尼作用K562细胞相比，伊马替尼分别联合3个GSK3抑制剂作用的K562细胞中t-GSK3β、t-GSK3α蛋白表达水平无差异，p-GSK3β、p-GSK3α、β-catenin蛋白表达水平升高。 结论:GSK3抑制剂可减弱伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的作用，可能是通过调控Wnt-β-catenin通路相关蛋白水平实现的。

目的:探讨木香烃内酯对慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/ADR多柔比星敏感性的影响及其机制。方法:取对数生长期K562/ADR细胞，分别以不同浓度木香烃内酯、多柔比星以及两药联合作用72 h，CCK-8法检测细胞增殖情况，计算细胞增殖率，获得两药半数抑制浓度（IC 50）。以10 μmol/L木香烃内酯、10 μmol/L多柔比星及两药联合作用于K562/ADR细胞48 h，流式细胞术检测细胞凋亡率，蛋白质印迹法检测p38-MAPK通路相关蛋白的表达水平。 结果:木香烃内酯与多柔比星联用组细胞增殖率均低于相应浓度两药单用组，差异均有统计学意义（均 P<0.05）。多柔比星对K562/ADR细胞的IC 50为（13.50±0.86）μmol/L，木香烃内酯为（7.30±0.55）μmol/L，差异有统计学意义（ t=7.044， P=0.002）。流式细胞术检测结果显示，10 μmol/L木香烃内酯和10 μmol/L多柔比星联用组K562/ADR细胞凋亡率均高于空白对照组、木香烃内酯单用组以及多柔比星单用组[（19.68±3.21）%比（2.96±0.87）%、（9.34±2.89）%、（9.18±2.13）%]，差异均有统计学意义（均 P<0.01）。与10 μmol/L木香烃内酯单用组和10 μmol/L多柔比星单用组相比，两药联用组凋亡抑制蛋白bcl-2表达下调，bad、p-p38、cleaved-caspase-3及cleaved-PARP蛋白的表达水平上调。 结论:木香烃内酯可增强多柔比星对慢性粒细胞白血病K562/ADR细胞增殖的抑制作用，促进多柔比星诱导细胞凋亡，其可能通过调控p38-MAPK通路逆转K562/ADR细胞的耐药性。

目的:探讨B7H3和纤维连接蛋白（FN）相互作用对人慢性髓性白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。方法:采用流式细胞术检测K562细胞中B7H3分子的表达，构建B7H3过表达细胞。采用免疫共沉淀技术检测B7H3与FN的相互作用。添加外源FN后，通过细胞实验检测细胞黏附和细胞凋亡的变化。Western blot法检测凋亡相关蛋白及PI3K/AKT信号通路的变化。结果:① K562细胞低表达B7H3分子，慢病毒转染后得到稳定表达B7H3的细胞系K562 OE-B7H3及其对照细胞系K562 NC-B7H3细胞。②B7H3与FN之间存在相互作用（ P=0.036）。③B7H3与FN的相互作用促进细胞黏附（ P<0.05），抑制细胞凋亡（ P<0.05）。④B7H3与FN相互作用激活PI3K/AKT信号通路（ P<0.05）。 结论:B7H3与FN相互作用促进了细胞黏附，可能通过激活PI3K/AKT信号通路抑制K562细胞的凋亡。

目的:建立降低抗体依赖性增强(antibody-dependent enhancement，ADE)效应的抗体表达系统，以期降低目标抗体的ADE效应。方法:对哺乳细胞抗体表达载体Fc区进行L234A和L235A点突变，建立抗体表达载体pFRT-IgG1κ-FcM。选取前期工作中获得的1株具有显著ADE效应的抗体Wt-WNV利用pFRT-IgG1κ-FcM系统进行表达，获得突变后抗体FcM-WNV。ELISA检测FcM-WNV与靶抗原西尼罗病毒包膜蛋白DⅢ(West Nile virus envelope protein-DⅢ，WNV E-DⅢ)的结合，流式细胞术分析FcM-WNV与人高亲和力IgG Fc受体hFcγRⅠ(hCD64)的结合。假病毒感染宿主细胞(BHK21和K562)试验检测FcM-WNV的体外中和活性。结果:FcM-WNV与Wt-WNV表达水平相当，能识别结合WNV E-DⅢ，且呈浓度依赖效应；与Wt-WNV相比，FcM-WNV与hCD64的结合力明显减弱，表现为荧光强度明显降低；与前期实验结果一致，Wt-WNV在5 μg/ml的浓度下具有明显增强WNV假病毒感染K562细胞的作用，而FcM-WNV在5 μg/ml浓度下，能有效阻断假病毒感染K562和BHK21细胞。结论:本研究建立的抗体表达系统可有效降低目标抗体的ADE效应。

目的:探讨RAF抑制剂SB590885、JAK抑制剂AZD1480、PI3K-mTOR双靶点抑制剂BEZ235等BCR-ABL下游通路抑制剂体外对慢性粒细胞白血病（CML）细胞的作用及BEZ235对CML细胞增殖、凋亡及伊马替尼敏感性的影响。方法:用不同浓度药物处理K562细胞，采用MTS法检测K562细胞的增殖抑制率，计算各药物48 h半数抑制浓度（IC 50）；采用流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡率，流式细胞术PI单染色法检测细胞周期。以不同浓度药物处理K562细胞、伊马替尼耐药的T315I突变的人CML KBM7R细胞、伊马替尼耐药的CML患者原代细胞，采用MTS法检测细胞增殖抑制率，分别计算各药物48 h的IC 50。分别单用1.0 μmol/L BEZ235、1.0 μmol/L伊马替尼或两者联合处理KBM7R细胞或CML患者原代细胞，采用流式细胞术PI单染色法检测KBM7R细胞周期，流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测CML患者原代细胞凋亡率，蛋白质印迹法检测KBM7R细胞p-AKT、cleaved Caspase-3、Cyclin D1蛋白的表达情况。 结果:SB590885、AZD1480、BEZ235均能抑制K562细胞的增殖，三者处理K562细胞48 h的IC 50分别为（11.49±3.14）、（4.83±1.26）、（0.37±0.21）μmol/L。SB590885、AZD1480、BEZ235均能促进K562细胞的凋亡，与未经药物作用的对照组比较，细胞凋亡率均升高（均 P<0.01）。SB590885和BEZ235诱导细胞G 0/G 1期阻滞（均 P<0.05），AZD1480诱导细胞G 2/M期阻滞（ P<0.05）。BEZ235可抑制K562、KBM7R细胞以及患者原代细胞的增殖，其48 h的IC 50分别为（0.37±0.21）、（0.43±0.27）、（0.49±0.24）μmol/L。与单用伊马替尼组相比，0.2 μmol/L BEZ235与不同浓度伊马替尼联用可增加对K562、KBM7R细胞和患者原代细胞的增殖抑制，降低伊马替尼的IC 50，其中，伊马替尼单用和联合BEZ235处理48 h后，K562细胞的伊马替尼IC 50分别为（0.14±0.05）、（0.09±0.04）μmol/L（ t=1.351， P=0.249），KBM7R细胞分别为（3.93±2.29）、（0.44±0.22）μmol/L（ t=2.837， P=0.047），原代细胞分别为（3.12±1.53）、（0.39±0.23）μmol/L（ t=3.925， P=0.042）。未经药物作用的对照组、单用1.0 μmol/L BEZ235、单用1.0 μmol/L伊马替尼及两药联合处理24 h后患者原代细胞凋亡率分别为（4.9±1.4）%、（13.1±3.2）%、（8.8±2.0）%、（40.6±6.0）%，差异有统计学意义（ F=71.031， P<0.01）。与单用伊马替尼相比，BEZ235联合伊马替尼处理12 h的KBM7R细胞p-AKT、Cyclin D1蛋白的表达降低，cleaved Caspase-3蛋白的表达升高。 结论:BCR-ABL下游通路抑制剂可有效抑制K562细胞的增殖，促进细胞凋亡。BEZ235能够抑制K562细胞、伊马替尼耐药的T315I突变的KBM7R细胞以及伊马替尼耐药的CML患者原代细胞的增殖，促进细胞凋亡，与伊马替尼具有协同作用。

目的:建立BCR：：ABL1 p210转录本荧光定量PCR（RQ-PCR）实验室自建检测方法和分析性能确认。方法:本研究采用欧洲抗癌计划（EAC）公布的BCR：：ABL1 p210转录本RQ-PCR检测的引物和探针序列建立了BCR：：ABL1 p210转录本RQ-PCR实验室自建检测（LDT）方法，通过WHO国际参考品获得转换系数（CF），并使用K562和HL60细胞系混合物构建两个不同水平的实验室内部质控品。回顾性分析慢性髓细胞性白细胞（CML）患者阳性标本，参考CLSI MM01-A3等指南评价实验室自建BCR：：ABL1 p210 RQ-PCR 方法的精密度、正确度、线性范围、分析灵敏度和分析特异性等参数。采用Bland-Altman法对LDT方法与美国FDA批准的BCR：：ABL1 p210转录本定量检测体外诊断（IVD）试剂盒检测结果进行一致性分析。结果:本中心通过WHO国际参考品校准获得的BCR：：ABL1国际标准值（BCR：：ABL1 IS）的CF为0.535。本研究建立的LDT方法在4个分子学反应（MR）水平（0.5、1.5、2.5、3.5）的BCR：：ABL1 IS 的重复性变异系数（ CV）分别为7.44%、5.33%、9.12%、18.06%，室内总不精密度 CV分别为7.99%、5.49%、10.95%、17.99%。2020至2022年本实验室所有美国病理学家协会（CAP）能力验证（PT）样本的MR值均在CAP允许的变异范围内，MR结果与CAP-PT MR 平均值强相关（ r=0.999， P<0.01），所有差值均在一致性界限范围内。本研究建立的LDT方法与Qiagen IVD试剂盒检测结果相关性高（ r=0.997， P<0.01）。e13a2转录本的BCR：：ABL1 IS线性范围为0.001%~7.454%，最大 CV值为64.09%。e14a2转录本的BCR：：ABL1 IS线性范围为0.002%~12.398%，最大 CV值为43.37%。e13a2转录本和e14a2转录本的最低检测限（LoD）分别为MR5.0（0.001% IS）和MR4.8（0.002% IS）；e13a2和e14a2转录本定量检测限（LoQ）均为MR4.7（0.002% IS）。该方法分析特异性为100%，与BCR：：ABL1 p190转录本检测无交叉反应性。 结论:本实验室自建的BCR：：ABL1 p210转录本RQ-PCR定量检测体系分析性能良好，可满足CML患者BCR：：ABL1融合基因的临床检测需求。

目的:研究小檗碱对白血病耐药细胞株K562/A02阿霉素耐药性及蛋白激酶C-α（PRKCA）的影响，探讨其作用机制。方法:体外培养人慢性粒细胞白血病K562细胞、阿霉素耐药株K562/A02，使用2.5~50.0 μmol/L的阿霉素处理，检测K562、K562/A02对阿霉素的耐药性，计算药物半抑制浓度（IC 50）；采用终浓度5 μmol/L的阿霉素溶液处理K562/A02细胞，并将K562/A02细胞分为对照组、抑制剂组（50 μmol/L PRKCA抑制剂）及小檗碱低、中、高剂量组，采用细胞计数（CCK-8）法检测各组细胞增殖抑制率，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，实时荧光定量PCR法检测PRKCA、多药耐药相关基因（MDR1）水平，Western blot法检测PRKCA、多药耐药相关蛋白（MRP）、P-糖蛋白（P-gp）表达情况。 结果:与K562比较，K562/A02对阿霉素的IC 50升高（ P<0.05）；与对照组比较，抑制剂组及小檗碱低、中、高剂量组细胞增殖抑制率、凋亡率升高（ P<0.05），PRKCA mRNA［（0.45±0.08）、（0.92±0.10）、（0.57±0.05）、（0.35±0.04）比（1.00±0.12）］、MDR1 mRNA［（0.73±0.08）、（0.87±0.09）、（0.65±0.07）、（0.41±0.05）比（1.00±0.11）］及PRKCA蛋白［（0.59±0.09）、（0.78±0.12）、（0.61±0.11）、（0.42±0.07）比（0.96±0.14）］、MRP蛋白［（0.62±0.08）、（0.79±0.13）、（0.62±0.10）、（0.41±0.06）比（0.98±0.14）］、P-gp［（0.55±0.08）、（0.75±0.12）、（0.59±0.09）、（0.35±0.06）比（0.92±0.15）］表达降低（ P<0.05），且小檗碱呈药物剂量依赖性（ P<0.05）；过表达PRKCA可显著抑制小檗碱逆转K562/A02细胞耐药的作用。 结论:小檗碱可能通过下调PRKCA逆转人白血病耐药株K562/A02对阿霉素的耐药性。