目的:利用CRISPR/Cas9 (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因的单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus 2，HSV-2)。方法:利用CRISPR/Cas9技术对外源基因EGFP插入HSV-2基因组的策略进行探索，设计如下4种插入策略：(1)经典的同源重组修复模式，即环状双侧同源臂供体介导的基因敲入；(2)线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入；(3)同源性非依赖介导的基因敲入；(4)利用稳表达Cas9和sgRNA的细胞株，进行环状双侧同源臂供体介导的基因敲入。结果:使用策略2、3和4均成功构建了携带EGFP的HSV-2，其中策略2的基因敲入效率最高，然后依次为策略3、策略4，策略1未观察到重组病毒的产生。蚀斑纯化后的重组病毒在7代内能稳定表达绿色荧光蛋白，并且和亲本株在Vero细胞上具有相似的生长特性。结论:线性化单侧同源臂供体介导的基因敲入效率更高，敲除载体的稳转细胞株能够有效地提高同源重组修复机制介导的基因敲入效率。

目的 研究不同治疗效果的结核患者肠道菌群、免疫功能,进一步探索不同治疗效果的结核患者之间是否存在差异菌群、免疫指标.方法 收集2020年1月-2021年2月长沙中心医院107例初治后的结核患者,通过查阅住院病历记录和采用面对面问卷访谈、登记的结果分为疗效不良组(n=32)和疗效良好组(n=75).采集患者粪便和血液样本,通过高通量测序、生物信息学技术以及流式细胞术、ELISA、结核药敏等相关技术,比较不同疗效组间样本肠道菌群多样性、免疫功能的差异.结果 与疗效不良组比较,疗效良好组γ-干扰素(IFN-γ)、CD4+％水平升高,肿瘤坏死因子(TNF-α)水平降低,差异均有统计学意义(t=2.222、2.377、2.104,P均＜0.05),而两组白细胞介素4(1L-4)、IL-10、CD3+％、CD4+/CD8+差异均无统计学意义(P均＞0.05).从目、科、属层面分析,未分类的丹毒丝菌在两组间差异均有统计学意义(U=983、983、982,P均＜0.05),其余细菌差异均无统计学意义(P均＞0.05);从细菌代谢及表型预测结果来看,两组在非同源末端连接、咖啡因代谢、吲哚生物碱合成及类固醇合成等细菌代谢功能方面差异均有统计学意义(Z=0.999、0.999、0.999、0.999,P均＜0.05);在需氧菌化能异养、宿主共生、芳香化合物降解、碳氢化合物降解和硝酸盐还原等功能方面差异均有统计学意义(Z=0.179、0.179、0.179、0.179、0.179,P均＜0.05);在感染耐药细菌方面,两组在感染耐多药结核分枝杆菌差异有统计学意义(x2=8.698,P＜0.05).结论 疗效不良的结核患者免疫功能较疗效良好的患者损伤严重;未分类的丹毒丝菌属可能是影响肺结核患者疗效不良的重要因素之一;肠道菌群的代谢功能低下、肠道菌群紊乱以及感染耐多药结核杆菌均对最终疗效有影响.

在自然界中,植物会遭受各种环境或内源因素导致的DNA损伤,其中DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs)的影响最为严重,如果修复不当,将导致基因组不稳定、基因突变甚至细胞死亡.一方面,植物进化出了强大且有序的损伤修复机制,以确保其存活及正常繁衍;另一方面,基于修复过程的容错性及致突变性,T-DNA插入、基因编辑、物理诱变等技术广泛应用于动植物品种改良.相较于哺乳动物,植物DSBs修复通路及其分子机制报道较为有限.本文综述了植物对DSBs损伤的响应、主要修复途径及关键因子,介绍了通路机制尚未完全解析的替代末端连接(alternative end joining,Alt-EJ)的最新研究进展;此外,探讨了重离子束引起的植物DSBs修复特征和多途径选择,以及基于不同DSBs修复途径的基因编辑技术的研究进展,旨在为深入了解植物DSBs损伤响应及修复的分子机制和研发高效生物育种技术提供参考.

DNA损伤引发细胞启动一系列DNA损伤应答(DNA damage response,DDR),包括DNA损伤修复、细胞周期检查点激活、细胞周期阻滞、各种细胞内信号转导途径的活化和细胞凋亡等.DNA损伤修复(DNA damage repair)是细胞维持基因组稳定性的重要机制,于2015年获得诺贝尔化学奖.DNA损伤修复途径主要包括:碱基切除修复(base-excision repair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)、错配修复(mismatch repair,MMR)、同源重组(homologous recombi-nation,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)等,分别在DNA单链断裂(sin-gle-strand break,SSB)或双链断裂(double-strand break,DSB)等损伤修复中发挥重要作用.DNA损伤修复缺陷与肿瘤发生发展密切相关,同时也是肿瘤治疗的重要靶点.DNA损伤修复通路的多聚ADP核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase,PARP)与乳腺癌易感基因BRCA1/2等存在合成致死(synthetic lethality)作用,使PARP抑制剂(PARP inhibitor,PARPi)成为第一个也是目前唯一上市的肿瘤治疗合成致死靶药.PARPi在卵巢癌及多种实体瘤治疗中疗效良好,使DNA损伤修复及相关DDR通路的合成致死靶药研发成为热点,其他在研靶点主要包括:共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia-mutated protein,ATM)、共济失调毛细血管扩张与 RAD3 相关蛋白(ataxia telangiectasia and Rad3 related protein,ATR)、DNA 依赖性蛋白质激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)、细胞周期检测点激酶 1(checkpoint kinase1,CHK1)、细胞周期检测点激酶2(checkpoint kinase 2,CHK2)、阻止有丝分裂的蛋白质激酶WEE1等.PARPi与其他DDR靶药、抗血管生成药物及免疫检查点抑制剂的联用,有可能成为克服PARPi耐药、提高疗效的有效手段和发展前景.本文针对DNA损伤修复及相关DDR通路的关键分子和潜在肿瘤治疗靶点进行综述,阐述了 DNA损伤修复相关通路的合成致死靶点研究及在卵巢癌的应用和前景,为基础研究及临床应用提供指导.

机体在体内因素如DNA碱基错配、自身不稳定性、机体代谢产生活性氧自由基(ROS)等,体外因素如辐射、化学毒物、药物、病毒和霉菌等作用下,可以造成DNA损伤. DNA损伤有碱基损伤、错配、DNA单链或双链断裂、嘧啶二聚体形成等多种类型. 其中,DNA双链断裂(DSB)是一种非常严重的损伤类型.

目的 放疗是肺癌最常用的治疗手段之一,化疗药物可增强放疗敏感性,但相关毒副作用及耐药的产生严重影响放疗疗效,因此,寻找新型放疗增敏药物具有重要的现实意义.方法 MTS法分析细梗香草总皂苷(LC)对肺癌细胞增殖的影响,集落形成实验、流式细胞术检测LC联合放疗后细胞集落形成率和凋亡的情况,Western blot和小干扰RNA探索其放疗增敏作用分子机制.结果 MTS示LC对肺癌细胞株有增殖抑制作用,呈剂量和时间依赖性,同时其还增强放疗诱导的细胞增殖抑制和凋亡潜能.LC与放疗联合放射增敏比均＞1.0,联合指数＜1.0,表明二者具有协同作用.Western blot示LC调控非同源末端连接过程中相关蛋白的表达水平,小干扰RNA下调DNA-PKcs的表达后,LC的放疗增敏作用减弱.结论 在非小细胞肺癌中LC通过抑制DNA损伤修复过程中的非同源末端连接而发挥放疗增敏作用.

目的 探讨Akt1增强胶质瘤放、化疗抵抗的机制.方法 通过免疫荧光实验检测正常星形细胞和4种恶性胶质瘤细胞(U87、U251、SF767以及U373)中泛素结合酶E2S(UBE2S)的表达情况;通过Western blot实验检测PTEN基因突变型和野生型胶质瘤细胞中UBE2S的表达差异;构建激活型Akt1载体,分别与UBE2S野生型或T152位点突变型载体共表达,观察PTEN/Akt信号通路对UBE2S的作用,以及UBE2S过表达后对非同源末端连接复合物的影响;采用流式细胞仪检测稳定敲低UBE2S的U87胶质瘤细胞对放、化疗的敏感性.结果 与正常星形细胞相比,胶质瘤细胞高表达UBE2S蛋白;PTEN突变型的胶质瘤细胞UBE2S的表达较野生型更稳定.构建激活型Akt1磷酸化UBE2S的T152位点,可促进UBE2S的稳定表达.UBE2S与Ku70、Ku80相互作用能促进Ku70的表达(P =0.009).免疫印迹结果显示,敲低UBE2S的表达后,Ku70、Ku80和DNA-PKcs的表达量显著降低(P＜0.001).流式细胞检测结果显示,UBE2S敲低可增强胶质瘤对放、化疗的敏感性(P＜0.001).结论 UBE2S在恶性胶质瘤中高表达;Akt1可磷酸化UBE2S的T152位点,从而增强UBE2S的稳定性;敲低UBE2S能降低非同源末端连接复合物介导的DNA修复效率,从而增强胶质瘤细胞对放、化疗的敏感性.

目的 比较DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs+/+)和DNA-PKcs-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)X射线诱导γ H2AX焦点形成的定量分析,并对鼻咽癌SUNE-1细胞进行X射线致DNA DSB动态变化.方法 采用蛋白印迹检测DNA-PKcs蛋白表达情况,细胞免疫荧光检测X射线5 Gy诱导的γ H2AX焦点形成,通过ImageJ软件分析γ H2AX焦点形成数量的差异.结果 DNA-PKcs在DNA-PKcs-/-和DNA-PKcs+/+MEF细胞中分别表达缺失和正常.应用γ H2AX焦点/细胞和γ H2AX焦点/mm2分析方法动态分析X射线诱导的DNA-PKcs+/+、DNA-PKcs-/-MEF细胞和SUNE-1细胞DSB形成的总体趋势一致;照后0.5~1.0 h大量γ H2AX焦点形成,DNA-PKcs+/+MEF细胞于照后6.0 h完成修复,DNA-PKcs-/-MEF和SUNE-1细胞X射线后于照后24.0 h完成修复.γ H2AX焦点/细胞的峰值出现在照后1.0 h,γ H2AX焦点/mm2的峰值则出现在照后0.5 h.对于DNA-PKcs+/+和DNA-PKcs-/-MEF细胞,γ H2AX焦点/细胞在照后0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h的不同,而γ H2AX焦点/mm2在照后3.0、6.0、12.0 h不同.结论 利用细胞免疫荧光动态检测照后致γ H2AX焦点/细胞或γ H2AX焦点/mm2的分析方法为动态定量研究DSB损伤及修复提供了新的思路.

乙肝病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV持续存在的来源,研究cccDNA的形成机制以及影响因素对乙型肝炎的治疗十分重要.cccDNA的形成途径大致有三种:①部分双链的松弛环状DNA (rcDNA)在细胞质中去除负链上的DNA聚合酶蛋白从而形成DP-rcDNA,DP-rcDNA在核转运蛋白的介导下进入细胞核,在核内利用宿主的酶系统完成了cccD-NA的最终形成,DNA聚合酶K(POLK)以及DNA连接酶参与其中.②细胞质中的线性双链DNA(dsl-DNA)去除负链上DNA聚合酶后形成DP-dslDNA,转运入细胞核内以后通过分子内的非同源重组合成cccDNA,Ku80参与其中.③细胞核内DP-rcD-NA形成一种末端重复的线性双链DNA(TR-dslDNA),TR-dslDNA经非同源重组形成cccDNA.

β-血红蛋白病(β-hemoglobinopathies)是严重危害人类健康的6种常见疾病之一,尽管其遗传分子机制已被阐释清楚,但目前除异基因骨髓移植外尚还缺乏根治性的治疗策略.近年来,基因组编辑技术的迅速发展及其在人造血干祖细胞中的应用为β-血红蛋白病的治疗开辟了新的方向.针对血红蛋白的基因突变,可利用同源重组介导的细胞内源性DNA损伤修复途径直接修复遗传缺陷,也可以利用非同源末端连接机制沉默抑制胎儿血红蛋白表达的分子,重新激活胎儿血红蛋白的表达以缓解β-血红蛋白病人的临床症状.本文从β-血红蛋白病的基因组编辑策略及尝试、临床转化平台的要素分析等方面对该病的基因组编辑治疗的研究进展展开综述,以期为β-血红蛋白病新型治愈方案的研究以及基因组编辑技术的临床转化提供参考.