目的:研究Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)在鲍曼不动杆菌致病性和耐药性中的作用。方法:收集2016年1月1日至12月31日温州医科大学附属第一医院分离自血流感染患者血液标本的45株鲍曼不动杆菌株，采用VITEK 2 Compact全自动微生物分析仪测定其对抗菌药物的敏感性，通过聚合酶链反应检测菌株T6SS主要效应蛋白编码基因溶血素调节蛋白的携带情况，对T6SS阳性鲍曼不动杆菌和T6SS阴性鲍曼不动杆菌分别进行生物膜形成能力检测、抗血清试验和体外竞争试验，收集并分析鲍曼不动杆菌血流感染患者的临床资料及转归情况。统计学分析采用 t检验、秩和检验和 χ2检验。 结果:45株鲍曼不动杆菌中24株T6SS阳性，阳性率为53.3%。T6SS阳性鲍曼不动杆菌对头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素和头胞吡肟的耐药率分别为95.8%、95.8%、66.7%、95.8%、79.2%、95.8%、79.2%和91.7%，高于T6SS阴性鲍曼不动杆菌的28.6%、28.6%、28.6%、28.6%、9.5%、23.8%、23.8%和28.6%，差异均有统计学意义( χ2＝22.12、22.12、6.51、22.12、21.83、24.72、13.79、18.97，均 P<0.05)。T6SS阳性鲍曼不动杆菌的生物膜形成能力、血清抗性和竞争能力均高于T6SS阴性鲍曼不动杆菌，差异均有统计学意义( t＝4.99、 Z＝－2.61、 Z＝－2.27，均 P<0.05)。重症监护病房(intensive care unit，ICU)来源鲍曼不动杆菌的T6SS阳性率为80.0%(16/20)，高于非ICU来源菌株的32.0%(8/25)，差异均有统计学意义( χ2＝10.29， P<0.05)，但鲍曼不动杆菌是否携带T6SS对患者病死率的影响差异无统计学意义( χ2＝1.74， P＝0.188)。 结论:T6SS阳性鲍曼不动杆菌具有较高的致病性，且其高耐药率使得治疗较困难，亟需引起临床医师尤其是ICU医师的高度重视。

肺炎克雷伯菌可引起多系统感染，是临床常见的病原菌。Ⅵ型分泌系统(T6SS)是广泛存在于革兰阴性菌膜内的分泌装置，通过接触依赖的方式将毒性效应物质传递给靶细胞，T6SS与细菌运动能力、黏附能力、定植能力、细菌间竞争能力、生物膜形成、细菌耐药相关的基因水平转移等相关。对T6SS的结构及其在肺炎克雷伯菌中作用的研究进展(包括肺炎克雷伯菌T6SS的调节、效应因子和临床研究)进行阐述，以期为肺炎克雷伯菌T6SS的进一步研究提供参考依据。

目的:对碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌ST191、ST195和ST208的毒力水平进行分析，探究流行克隆株之间的毒力因子差异。方法:对2011—2019年中国人民解放军总医院第五医学中心（北院区）分离的ST191、ST195和ST208共计233株鲍曼不动杆菌进行基因组二代测序，将基因组数据与细菌毒力因子数据库（VFDB）比对，探究菌株的毒力基因存在情况，同时采用大蜡螟感染生存模型评估菌株的毒力水平，采用Kendall′s tau-b等级相关分析菌株毒力水平与毒力基因的相关性。结果:共收集鲍曼不动杆菌ST191克隆38株，ST195克隆104株，ST208克隆91株。大蜡螟感染生存试验中ST191平均致死率为23.0%，高毒力菌株有3株（7.9%）；ST195平均致死率为53.0%，高毒力菌株有34株（32.7%）；ST208平均致死率为47.0%，高毒力菌株有20株（21.9%），ST191与ST195（ χ 2=13.9， P<0.001）和ST208（ χ2=15.2， P<0.001）的大蜡螟致死率有显著差异。经比对数据库中7类共120个鲍曼不动杆菌毒力基因，发现克隆株携带的毒力基因具有显著差异，其中Ⅵ型分泌系统相关基因（ clpV/tssH、 hcp/tssD、 tagX、 tssA、 tssB、 tssC、 tssE、 tssF、 tssG、 tssK、 tssL、 tssM）和糖转移酶基因 ACICU_RS00475在ST191菌株中普遍缺失（0），相反ST195（99.0%）和ST208（>82.0%）菌株普遍携带此类基因。克隆株的大蜡螟致死率与其携带毒力基因相关（ clpV/tssHP<0.001、 hcp/tssDP=0.001、 tagXP<0.001、 tssAP<0.001、 tssBP=0.001、 tssCP=0.001、 tssE P=0.001、 tssF P=0.001、 tssGP<0.001、 tssKP<0.001、 tssLP<0.001、 tssMP=0.001， ACICU_RS00475 P=0.001）。 结论:碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌流行株中，ST191的大蜡螟致死率较ST195和ST208低，可能与其Ⅵ型分泌系统和糖转移酶基因的缺失有关。

目的:研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法:采用Western Blot检测河弧菌野生株、 aphA缺失株（Δ aphA）和 aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子- lux 融合冷光系统检测野生株和Δ aphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因 tssB2 、hcp（ tssD2）和 vgrG（ tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA 相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点；采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与 hapR启动子的结合。 结果:Δ aphA中 tssB2 、hcp（ tssD2）、 vgrG（ tssI2）和 hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇 、tssD2a 、tssI2a和 hapR的启动子活性在Δ aphA中均高于野生株，而 tssD2b启动子活性则低于野生株。 tssD2a和 tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大，在 tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点，将其中的保守位点ATG替换为CGA， tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示，AphA与 hapR启动子直接结合。 结论:AphA在转录水平直接抑制 hapR的表达，间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对 tssD2a和 tssD2b呈现相反的调控模式，AphA可直接与 tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控 tssD2b的表达。

鲍曼不动杆菌( Acinetobacter baumannii, Aba)和肺炎克雷伯菌( Klebsiella pneumoniae, Kpn)等条件致病性革兰氏阴性菌导致的院内感染，给医疗卫生管理和人类生命健康带来极大挑战。多重耐药菌株的播散及细菌毒力的增加亟需新的治疗策略应对。Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)是多种革兰氏阴性菌编码的一种保守"分泌装置"，能够以接触依赖的方式将效应蛋白注射到其他原核或真核细胞中，实现抗菌和抗宿主功能，与细菌的环境适应性、竞争力及宿主内定植能力密切相关。T6SS基因簇由核心基因、效应基因以及相关基因组成，其编码的T6SS效应蛋白存在高度多样性，在病原菌感染过程中发挥着重要作用。本文旨在对鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌T6SS介导的细菌间竞争、宿主内定植、接合质粒相互作用以及T6SS表达调控等方面的研究进展进行综述，为未来研究T6SS相关抗菌活性、毒力和耐药等提供理论基础。

Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ Secretion System,T6SS)是细菌中新发现的一种以直接接触方式释放毒性效应蛋白杀死真核"捕食者"或原核"竞争对手"的蛋白分泌装置,被喻为细菌的"分子武器",在细菌环境适应性、致病性和基因的水平转移等方面都发挥重要作用.约25％的革兰氏阴性细菌基因组中存在T6SS编码基因簇,存在广泛,越来越多的研究支持T6SS是细菌间生态位竞争的关键因素.T6SS发挥生物学功能的效应蛋白具有高度多样性,并不具有保守的特征序列,涉及的调控机制复杂,因此是T6SS研究领域的热点和难点.河弧菌(V.fluvialis)作为一种新发的食源性病原菌,T6SS的数量、组成和生理功能具有独特性,与其广泛的环境适应性及致病性有关.本文综述了河弧菌T6SS的组成结构、功能活性及调控机制等.

[目的]探讨脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)中六型蛋白分泌系统(T6SS)对肠道屏障的影响及作用机制.[方法]采用自杀载体构建B.fragilis T6SS缺陷株.建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎小鼠模型,并分别补充PBS,B.fragilis WT和B.fragilis ΔT6SS,随后比较三组小鼠疾病特征、肠道屏障完整性的差异.利用荧光定量PCR和免疫组化检测小鼠紧密连接蛋白的表达.采用非靶向代谢组学比较各组小鼠肠道差异代谢物.[结果]T6SS缺失不影响B.fragilis的生物活性.与PBS对照组相比,B.fragilis WT明显改善小鼠的体重丢失、结肠长度等疾病指标,表现出对DSS诱导的肠炎的保护性,而B.fragilis ΔT6SS随着T6SS的敲除丧失了对DSS诱导的肠炎的保护性.小鼠血清中异硫氰酸荧光素葡聚糖含量和肠道病理切片均表明B.fragilis T6SS能改善小鼠肠道屏障的完整性.荧光定量PCR和免疫组化均表明B.fragilis T6SS影响肠道紧密连接蛋白的表达.非靶向代谢组学分析表明,与B.fragilis ΔT6SS组相比,B.fragilis WT组显著上调 96 个肠道差异代谢产物,其中多个代谢产物富集到胆碱能突触代谢和甘油磷脂代谢相关通路.[结论]拟杆菌T6SS改变肠道代谢组并提高肠道细胞紧密连接蛋白的表达,改善肠道屏障的通透性,参与到拟杆菌对肠道屏障的保护性.

[目的]探究生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的差异基因表达情况,为今后研究生物膜形成调控机制提供基因信息.[方法]以非生物膜形成条件下为参照,采用Illumina HiSeq测序平台进行转录组测序(RNA sequencing,RNA-seq)研究,分析生物膜形成中间状态下副溶血弧菌的基因表达情况,并采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)进行验证.[结果]本研究共获得979个差异显著性表达基因(differentially expressed gene,DEG),其中下调基因379个,上调基因600个.基因本体(gene ontology,GO)分类分析结果显示,共有363个DEGs注释到分子功能、细胞组分和生物学过程3个一级分类和30个二级分类;京都基因和基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代谢途径分析结果显示,共有 706 个 DEGs归到37个代谢通路中(Q value＜0.05),差异表达基因主要集中在细胞代谢和转运通路上;蛋白相邻类的聚簇(clusters of orthologous groups,COG)分类结果显示,有888个DEGs可归为20个类别,涉及DEGs最多的为氨基酸转运与代谢、一般功能预测基因、能量产生与转换以及未知功能基因.qPCR验证挑选的DEGs变化趋势均与RNA-seq的结果一致.此外,从转录组数据中共筛选出10个c-di-GMP代谢相关基因、1个侧生鞭毛蛋白基因(lafA)、13个极生鞭毛合成相关基因、6个荚膜多糖合成相关基因、6个胞外多糖合成相关基因、5个Ⅳ型菌毛合成相关基因、膜融合蛋白(membrane fusion protein,Mfp)基因(cpsQ-mfpABC)、14 个 Ⅲ 型分泌系统 1(T3SS1)相关基因、14个Vp-PAI基因(1个tdh2和13个T3SS2基因)、3个Ⅵ型分泌系统1(T6SS1)相关基因、6个T6SS2基因、45个推定调控子基因和15个推定的外膜蛋白基因.[结论]生物膜形成引起副溶血弧菌基因表达谱发生明显变化,差异表达基因中包含生物膜形成相关基因、关键毒力基因和许多推定调控子基因等,这为后续研究生物膜形成调控机制提供重要信息.

在漫长的进化过程中,细菌为了适应各种各样的环境,进化出了多种大分子分泌系统以帮助菌体生存以及侵袭宿主[1].迄今为止,在细菌中己发现了 Ⅰ～Ⅸ型分泌系统(Type Ⅰ-Ⅸ secretion systems,T1SS～T9SS),这些分泌系统以一步式或两步式途径将底物跨膜转移至胞外[2-4].

为探索伤寒沙门菌Ⅵ型分泌系统(type 6 secretion system,T6SS)对SopE表达的影响,阐明其中的分子机制,本研究利用自杀质粒同源重组法构建携带sopE::3×Flag的伤寒沙门菌野生株(WT-pBAD33)、T6SS功能分子缺陷株(ΔsciG-pBAD33)和回补株(C-ΔsciG),用构建成功的菌株感染巨噬细胞THP-1并在模拟巨噬细胞内环境(LPM培养基、微需氧)下培养,通过实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)与蛋白质印迹法(Western blot,WB)试验探索 T6SS 对SopE表达的影响,采用β-半乳糖苷酶活性检测来进一步验证sopE基因启动子的转录水平,Ni柱纯化T6SS功能蛋白SciG,电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)研究SciG蛋白对sopE基因启动子的调控作用.结果显示:ΔsciG-pBAD33中SopE表达水平较于WT-pBAD33明显降低;SciG蛋白不能直接与sopE基因启动子区域结合.本研究结果表明,伤寒沙门菌T6SS影响了 SopE的表达,但是其功能蛋白SciG不能直接调控sopE基因的表达.