目的:研究亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)上调转录因子Krüppel样因子5(Krüppel-likefactor5,KLF5)促进Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)产生炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-23 的作用.方法:①建立大鼠Thy-1N模型和体外培养大鼠GMC,用Western blot(WB)检查Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的GMC中KLF5和IL-23的表达.②分别将KLF5过表达质粒(pIRES2-KLF5)或KLF5小干扰质粒(shKLF5)转染GMC,通过实时荧光定量PCR和WB检测KLF5和IL-23的mRNA和蛋白水平.③将IL-23全长启动子荧光素酶报告基因质粒(pGL3-IL-23-FL)转染GMC,再给予sublytic C5b-9刺激,或将pGL3-IL-23-FL与pIRES2-KLF5或shKLF5共转染GMC,用荧光素酶报告基因实验检测IL-23启动子活性的变化.④将慢病毒(lentivirus,LV)包装的LV-shKLF5和LV-shCTR行肾动脉灌注术导入大鼠肾组织,经小动物脏器可见光三维成像和冰冻切片观察GFP表达,证实LV-shCTR在肾组织中富集效率.之后再复制大鼠Thy-1N,用WB检查肾组织中KLF5和IL-23的蛋白表达.结果:①Thy-1N大鼠的肾组织和sublytic C5b-9刺激的GMC中,KLF5和IL-23的表达均显著升高,且KLF5的表达高峰稍早于IL-23.②在GMC中过表达或敲低KLF5能分别引起IL-23表达的升高或降低.③Sublytic C5b-9刺激或KLF5过表达均可增加GMC中IL-23启动子的活性,但敲低KLF5后可明显下调由sublytic C5b-9刺激GMC诱导的IL-23启动子活性.④敲低Thy-1N大鼠肾组织中KLF5的表达后,其肾组织中IL-23的表达水平明显降低.结论:大鼠Thy-1N发病早期,sublytic C5b-9刺激GMC后可通过上调KLF5促进IL-23基因的转录与表达.

目的 灌注制备家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾去细胞生物支架,探究三种肾支架对共培养种子细胞HEK的影响.方法 取健康成年家猪10 头、新西兰白兔28 只、SD大鼠28 只,分别将取出的肾脏随机均等分为正常组和支架组,支架组由肾动脉依次灌入肝素、1％ Triton X-100和1％ SDS溶液完成去细胞化.两组肾分别作组织形态学鉴定并检测机械力学性质.去细胞支架作组织爬片与人胚肾上皮细胞共培养,观察细胞在支架爬片上的生长状况,免疫荧光检测人胚肾上皮细胞PCNA及DAPI表达量作灰度分析.结果 家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾脏经灌注去细胞后HE核染色阴性,Masson 染色显示胶原蛋白阳性,Collagen I 和Collagen IV 荧光染色阳性,电镜扫描可见去细胞支架内蜂窝状孔洞结构,并可见典型的肾小球龛样结构;支架组弹性模量与正常组肾弹性模量差异无显著性,支架组PCNA/DAPI值均高于空白对照组,而三种支架组之间PCNA/DAPI 值无显著性差异.结论 本研究灌注去细胞方法可去除家猪、新西兰白兔、SD大鼠肾内的细胞及细胞核,保留细胞外基质,维持细胞外基质的三维空间结构和机械力学强度,是一种可靠有效的制备三者肾去细胞生物支架方法,灌注制备的去细胞支架均可提高异种共培养人胚肾上皮细胞HEK的增殖活性,且这种提高作用在家猪、新西兰白兔和SD大鼠之间并无物种差异性.

目的 观测小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)诱导的胰岛素分泌细胞(IPCs)在大鼠胰腺脱细胞支架上的生长及功能发挥.方法 经脾动脉持续灌注洗脱剂制备胰腺脱细胞支架,对其进行组织染色,DNA、糖胺多糖(GAG)含量,生物相容性检测.含小鼠肌腱膜纤维肉瘤癌基因同系物A(MafA)、胰腺十二指肠同源异型盒-1(PDX-1)和神经源性分化因子-1(NeuroD1)的腺病毒联合导入mBMSCs,免疫荧光、实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测胰岛素(Insulin)表达;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测不同浓度葡萄糖刺激后胰岛素分泌情况.IPCs再种植于脱细胞支架内,培养后行苏木素-伊红(HE)染色、免疫荧光、FQ-PCR检测细胞生长及功能发挥.结果 经灌注后未见细胞残留,可见细胞外基质(ECM)保留,DNA定量提示细胞含量为(44.92±3.89) ng/mg(t=15.160,P=0.001),GAG含量为(30.27±2.70) ng/mg,(t=2.862,P=0.046),免疫组织化学显示胶原Ⅰ、纤连蛋白保留.三基因修饰的mBMSCs Insulin表达阳性,葡萄糖刺激试验显示其对不同浓度葡萄糖有反应.将IPCs在胰腺脱细胞支架内循环灌注培养,HE染色显示细胞在支架内生长良好,免疫荧光和FQ-PCR显示Insulin表达阳性,与二维培养比较,Insulin表达提高(t=15.030,P=0.004).结论 制备的大鼠胰腺脱细胞支架保存了基本的脉管结构及ECM,生物相容性良好.PDX-1、NeuroD1和MafA协同促进mBMSCs分化并获得Insulin合成和分泌能力.经三维循环灌注培养,IPCs能够在支架内生长及发挥功能,且细胞功能得到促进.

背景:脱细胞技术的日益发展为肿瘤组织工程提供了新的培养平台,它充分模拟肿瘤在体内生长的微环境,可以为肿瘤研究领域提供新的手段.目的:综述肿瘤组织工程中脱细胞支架的应用.方法:以"tumor engineering;biomaterials;scaffold;3D culture;decellularized;tumor microenvironment;ECM"为关键词,检索PubMed数据库1995至2017年相关文献.结果与结论:利用脱细胞技术保留的细胞外基质支架是一个无论在生理生化、几何空间结构方面都很理想的研究细胞培养的平台,它不仅含有基本的细胞外基质结构成分――蛋白质和多糖,以及特定的生长因子和细胞因子,还保留了完整而特定的脉管结构,这使得它可以通过灌注装置等生物反应器来模拟体内营养交换的机制,这为肿瘤研究提供一个非常接近体内真实情况的研究平台.近年来,随着组织工程的发展,这种三维立体培养逐渐成为肿瘤生物学领域研究的热点,在体外建立细胞间以及细胞与细胞外基质之间的相互联系,模拟真实肿瘤微环境,再造体外肿瘤模型中得到了极大的应用.随着脱细胞技术的广泛应用和不断完善,将成为研究肿瘤生物学行为、药物筛选及靶向治疗等方面研究的有效工具.

目的 建立体外血管发生的三维立体模型,观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)对心肌梗死区血管新生的影响.方法 将36只SD大鼠随机为3组,其中实验组、模型组两组结扎冠状动脉左前降支,构建急性心肌梗死动物模型;空白对照组只穿线,不结扎前降支血管.建模成功后,实验组于局部梗死心肌内注射0.5 ng/mL VEGF 50μL,模型组注射等量0.9%氯化钠溶液.取前降支近端梗死心肌组织移植在三维立体培养模型中,每天观察新生血管,培养2周内,记录心肌梗死区新生血管形态及密度,2周后免疫组织化学染色验证梗死心肌周围新生血管.结果 (1)空白对照组,模型组及实验组缺血心肌区域均可见新生血管生成,免疫组织化学显示新生血管碱性成纤维细胞生长因子及平滑肌肌动蛋白染色阳性;(2)实验组新生微血管密度多于模型组及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 VEGF在体外血管三维立体模型中能增加心脏组织块血管新生,从而促进冠状动脉侧支建立,提高冠状动脉灌注,有希望成为心肌梗死治疗的新手段.

目的 探讨一期输尿管软镜钬激光碎石术治疗输尿管结石合并输尿管迂曲的可行性、有效性、安全性.方法 回顾性分析2017年3月至2018年12月收治的69例输尿管结石合并输尿管迂曲患者的病例资料.男30例,女39例.年龄19 ～ 67岁,平均45岁.输尿管结石长径0.6 ～3.0cm,平均1.1 cm.24例术前CT平扫三维重建、静脉尿路造影或泌尿系CTU重建检查可见输尿管结石远端输尿管迂曲,余45例术中发现输尿管迂曲.所有患者术前均未预置输尿管支架管.术前尿培养阴性或经抗感染治疗后复查为阴性方可手术.术中输尿管硬镜检查发现输尿管迂曲后,置入输尿管鞘至迂曲下方,输尿管软镜经鞘进入输尿管,在持续灌注状态下,观察输尿管迂曲方向,控制输尿管软镜头端沿迂曲方向弯曲并轻柔进镜,通过迂曲处发现结石后,将结石推回肾脏碎石.对于无法推动的结石,则在输尿管内将结石碎块化后推回肾脏进一步粉末化.术后常规留置输尿管支架管.结果 本组69例中64例成功行一期输尿管软镜钬激光碎石术,手术成功率92.8％.5例手术失败者中,1例因迂曲处输尿管壁薄,输尿管穿孔,改行开放式输尿管切开取石术;1例因迂曲上方结石巨大(结石长径3.0 cm),输尿管软镜通过迂曲处后,无法推动结石及原位碎石,改行开放式输尿管切开取石术;1例因输尿管软镜无法通过输尿管上段迂曲处,改行经皮肾镜取石术;1例因输尿管下段狭窄,无法置入输尿管软镜鞘,留置输尿管支架管后行二期输尿管软镜取石术;1例因术中发现结石梗阻上方尿液浑浊,留置输尿管支架管后行二期输尿管软镜碎石术.64例成功手术者术后1、3个月的结石清除率分别为90.6％ (58/64)、95.3％ (61/64).并发症发生率为7.8％ (5/64),包括发热4例,患侧腰痛1例,均为Clavien分级Ⅰ～Ⅱ级.结论 一期输尿管软镜钬激光碎石术治疗输尿管结石合并输尿管迂曲安全、有效、可行.

目的 体外建立一个基于人脂肪肝脱细胞支架的肝癌三维模型.方法 通过反复冻融、梯度浓度的SDS和1％Triton X-100经门静脉和肝动脉双重灌注及组织块在Triton X-100中反复震荡的方法制备人脂肪肝脱细胞基质(hFLM).在hFLM内培养HepG2细胞,检测其存活、形态、增殖及黏附分子表达情况.结果 采用双重灌注的方式显著缩短了支架制备的时间,同时保留了肝脏的细胞外基质成分及三维结构.HepG2细胞在hFLM内培养15 d,存活良好,并呈现与体内相似的肿瘤增殖模式.而且,hFLM培养的HepG2细胞和皮下成瘤组均低表达E-cadherin,高表达Vimentin,与二维培养组正好相反.基于hFLM的肝癌模型缺少有效的血管网络,缺乏足够的营养转运,可能导致后期细胞增殖减缓.hFLM培养的HepG2细胞第12天时PCNA指数较第6天时降低了29.3％.结论 建立一种新的人脂肪肝脱细胞方案,并验证了基于hFLM体外构建肝癌模型的可行性.

目的:探讨C57BL6小鼠支气管肺泡干细胞(BASCSs)体外分离、鉴定及其三维培养体系的构建方法,为进一步研究BASCSs的相关特性奠定实验基础.方法:选用C57BL6成年雄鼠,完整分离肺组织,1×PBS灌洗后,经支气管分次灌注Elastase酶进行消化,以锐器切碎肺组织,加入DNA酶使细胞更好地分散开.用75μm细胞筛去除未消化的组织块,所得细胞悬液以荧光标记的CD31、CD34、CD45、SCA-1、EpCAM抗体染色,流式细胞仪分选CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+细胞,细胞与Mlg2908细胞(小鼠肺成纤维细胞株)按(1×103):(1×106)的比例混合,以Matrigel为基质构建三维培养体系.结果:通过Elastase酶消化肺组织,每只成年小鼠可得到有核细胞总数(1.6～1.8)×107个,流式细胞技术结果显示,CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+细胞约占EpCAM+细胞的22％;将支气管肺泡干细胞、Mlg2908细胞和Matrigel混合培养,4 d后可见克隆形成.随着培养时间延长,克隆数量逐渐减少.8 d后大部分克隆直径达50μm,形态出现分化,克隆可维持至15 d.结论:建立了一种简单、高效的分离、鉴定及三维培养小鼠BASCSs的方法.

目的:研制一种模块化三维灌注培养系统,解决目前培养系统结构复杂、难消毒、易污染的问题.方法:该系统主要由生物反应器模块、氧合模块、动力模块以及换液模块构成,各模块壳体通过3D打印制作.其中生物反应器模块主体为80 ml蓝口瓶,装载培养基及细胞支架复合物.氧合模块装载膜肺、空气过滤器、气泡过滤器等,为培养系统的核心组件.动力模块由蠕动泵和空气泵组成,为培养基及气体提供动力.换液模块中装有深紫外LED灯,可进行消毒和更换培养基.结果:通过该系统进行大鼠脾脏脱细胞支架培养,细胞与支架黏附紧密、生长状态良好,且未发生污染.结论:该系统具有结构合理、易消毒、污染少、制作成本低、稳定性高、易于扩展且操作简单的优点,可很方便地进行基于脱细胞支架的三维灌注培养,值得推广应用.

目的 分析复合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)的脱钙骨基质(DBM)对T淋巴细胞免疫能力和骨髓间充质干细胞(BMMSCs)迁移能力的体外调控作用.方法 通过特殊负压灌注装置将纤维蛋白凝胶复合CTLA4溶液灌注到DBM,构建复合CTLA4的DBM,并通过扫描电镜观察其微观形态.分离外周血单核细胞(PBMCs),通过植物血凝素(PHA)激活T淋巴细胞来构建免疫激活微环境.将复合CTLA4的DBM在培养基中孵育5、10、20、30、40 d,ELISA检测CTLA4的浓度,由此计算CTLA4的累积释放率.将PHA预处理的PBMCs与复合CTLA4的DBM进行Transwell共培养,ELISA检测培养基中IL-2和IFN-γ的含量.分离BMMSCs,Transwell共培养法分析复合CTLA4的DBM对BMMSCs增殖和迁移能力的影响.结果 复合CTLA4的DBM结构完整有序,具有良好的三维网络结构.复合材料中CTLA4在5、10、20、30、40 d的累积释放率分别为(11.3％±1.9％)、(27.9％±3.7％)、(48.4％±3.6％)、(62.8％±3.8％)和(83.0％±2.5％).与单纯的DBM相比,与复合CTLA4的DBM共培养可显著减少培养基中IL-2(P=0.0004)和IFN-γ(P=0.0007)的含量,增强BMMSCs的增殖能力(P=0.0006)和迁移能力(P=0.0004).结论 复合CTLA4的DBM在体外环境下具有抑制T淋巴细胞免疫能力和增强BMMSCs迁移能力的作用.